外泌体非编码RNA在非小细胞肺癌获得性耐药中的研究进展*

赵林林 王艳亭 李小江 李翀 杨仕蕊 顾丽丽 王晓群 陈鸿祥 贾英杰

近年来，肺癌已成为全球死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85% 左右[1]。根据美国国立综合癌症网络（NCCN）指南，早期NSCLC 可以通过手术完全治愈，但由于缺乏有效的早期诊断筛查手段，大多数NSCLC 患者在确诊时已处于Ⅲb 期甚至Ⅳ期，超过81%的患者在确诊时无手术指征，近70%的患者术后需要化疗或靶向治疗[2]。然而，NSCLC 获得性耐药严重影响化疗和靶向治疗的疗效以及患者的生存期。NSCLC 获得性耐药机制复杂[3]，目前研究多集中在三磷酸腺苷结合盒转运体（ATP-binding cassette transporter，ABC）异常表达、DNA 损伤修复的改变和细胞凋亡的异常、细胞自噬及肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）等方面，确切的机制仍不清楚。近年来研究表明，外泌体（exosome）作为细胞间信号传递的媒介，可以通过介导肿瘤免疫逃逸、侵袭转移及肿瘤耐药等过程在肺癌的发生发展中发挥重要作用[4]，肿瘤来源或与肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤耐药的重要机制，可以通过传递核酸、蛋白质等赋予敏感细胞耐药性[5]。本文对近年来外泌体非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）相关的NSCLC 获得性耐药的研究进展进行综述。

1 外泌体生物学特性

外泌体是具有双层膜结构的胞外膜性囊泡，直径30～150 nm，在蔗糖中的密度为1.13～1.19 g/mL，电镜下呈现杯托样结构[6]，是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一种。1983年，Pan 等[7]在研究绵羊网织红细胞成熟过程中首次发现了EVs 的存在。根据直径和生成机制不同，EVs 被分为外泌体、凋亡小体、微囊泡和肿瘤小泡。外泌体主要通过胞吐释放至细胞外，可以由多种类型的细胞主动分泌，被发现存在于体液之中，如血液、尿液、胸腔积液、唾液、支气管肺泡灌洗液和羊水等[8]。外泌体被释放到细胞外环境后，经由体液循环，通过直接靶向细胞受体信号、与受体细胞质膜融合和内化到受体细胞等方式，将其内容物输送到细胞质中，实现细胞间的信息交流[9]。目前已知的外泌体相关信息传递途径：1）外泌体和靶细胞表面受体之间直接相互作用；2）外泌体表面受体裂解，其受体片段与靶细胞上受体之间相互作用；3）外泌体膜与靶细胞质膜融合，释放外泌体进入细胞胞浆；4）靶细胞通过吞噬作用使整个外泌体内化[10]。外泌体介导信号传递给受体细胞或组织，是治疗癌症和其他疾病的一种很有前途的诊断生物标志物和治疗工具[8]。

来源不同的外泌体内含物成分存在差异，但基本均含有蛋白质、脂质及核酸等。到目前为止，在不同类型细胞的外显体中，已识别出9 769 种蛋白质、1 116种脂质体、3 408 种信使RNA（messenger RNA，mRNA）、2 838 种microRNA（miRNA）[11]。外泌体富含蛋白质，如四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81、CD82），参与细胞渗透、侵袭和融合；热休克蛋白（HSP70、HSP90）作为应激反应的一部分参与抗原结合和提呈；参与外泌体释放的多泡体（multivesicular body，MVB）形成蛋白质（Alix，TSG101）；以及负责膜转运和融合的蛋白质（annexins 和Rab）等。其中TSG101、HSP70、CD81 和CD63 是常见的外泌体标记蛋白[12]。此外，脂质如神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二酰甘油酯、胆固醇、鞘磷脂和溶血磷脂酸也存在于外泌体膜上。外泌体还携带核酸（DNA、mRNA、miRNA 和其他ncRNA）信号。目前外泌体的主要提取方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法等。

2 外泌体与NSCLC 获得性耐药

耐药是导致肿瘤治疗失败的主要原因，包括原发性耐药和获得性耐药。获得性耐药是在药物治疗过程中肿瘤细胞发生基因突变或表观遗传改变而产生的耐药表型。获得性耐药机制复杂，可归因于细胞内化疗药物浓度降低、癌基因或抑癌基因表达改变、DNA 损伤修复增强、上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）、自噬和肿瘤的高酸性微环境等[5]。近年来，越来越多的证据强调了外泌体在NSCLC 获得性耐药中的重要作用，外泌体参与肿瘤微环境中供体细胞和受体细胞之间的信息交换，亲代细胞释放的外泌体可与靶细胞相互作用，影响靶细胞表型特征[13]，耐药肿瘤细胞脱落的外泌体通过药物外排泵和ncRNA的转移等机制将耐药表型转移到药物敏细胞以传递耐药性[14]。因此，外泌体可能具有一组特定的ncRNA（miRNA、lncRNA、circRNA 等），通过改变细胞生长将耐药表型转移到敏感癌细胞诱导抗凋亡程序，参与NSCLC 获得性耐药。

2.1 miRNA

与经典的由直接黏连、特殊链接及可溶性生长因子所调控的细胞间信息传递不同，外泌体被认为是一种新型细胞间信息传导机制，参与miRNA 介导的靶细胞功能调节。miRNAs 是一类内源性长度为20~24 个核苷酸的单链ncRNA。主要通过与靶基因3’UTR的配对，参与调控许多重要生理活动[15]。研究表明，miRNA 在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭转移、预后、多药耐药等方面起着关键作用。循环miRNA 可存在于外泌体中，在细胞间传递发挥其调节作用。在原发性肿瘤微环境中，癌细胞分泌的外泌体和miRNA 可以被其他细胞摄取，对受体细胞进行基因组范围的基因表达调控[16]。外泌体保护循环miRNA 免受降解，保证其稳定性，并在血液中循环，与循环miRNA 相比，外泌体miRNA 更加稳定、灵敏和特异。

miRNA 是研究最深入的外泌体ncRNA，通过与靶基因特异性结合来调节蛋白质水平而发挥作用。Qin 等[17]通过miRNA 芯片的方法证明了A549/DDP细胞和A549 细胞之间存在11 个上调的差异表达外泌体miRNAs 和31 个下调的差异表达外泌体miRNA，通过靶基因预测和通路分析，发现这些外泌体miRNA 大多数与耐药有关[18]。Yuwen 等[19]在NSCLC 铂类耐药患者和铂类敏感患者的循环外泌体miRNA 中，发现表达差异最大的6 个外泌体miRNA，包括miRNA-425-3p、miRNA-1273h、miRNA-4 755-5p、miRNA-9-5p、miRNA-146a-5p和miRNA-215-5p。Liang 等[20]通过miRNA 微阵列技术及生物信息学分析，筛选出A549 细胞外泌体中与吉西他滨耐药相关的miRNA，包括let-7d-5p、let-7i-5p、miRNA-17-5p、miRNA-23b-3p。此外，肺癌组织及外泌体中miRNA-96 的表达明显高于正常肺组织，进一步研究发现，miRNA-96 可通过下调耐药相关基因LMO7 改变肺癌细胞的化疗敏感性[21]。Wei 等[22]还发现对吉西他滨耐药的A549（A549-GR）细胞来源的外泌体通过小窝蛋白和脂筏依赖的内吞作用被亲本敏感细胞内化，从而实现miRNA-222-3p 的转运，外泌体miRNA-222-3p 通过直接靶向SOCS3 的启动子促进迁移、侵袭、抗凋亡和吉西他滨耐药。外泌体还可以将miRNA-100-5p 转移到受体细胞，mTOR 是其潜在的靶基因，从而调节细胞对顺铂的敏感性[18]。此外，外泌体miR-512 和miR-373 也显示与顺铂敏感性增加和肿瘤进展抑制相关[23]，而外泌体miRNA-204-5p、miRNA-139-5p、miRNA-29c-5p、miRNA-551b-3p、miRNA-29b-2-5p 和miRNA-204-3p 与肺癌的阿霉素耐药相关[24]。除肿瘤细胞源性外泌体外，Wu 等[25]发现人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）来源的外泌体（BMSC-exo）miR-193a 通过下调LRRC1，抑制NSCLC 顺铂耐药细胞的集落形成、侵袭、迁移和增殖，并促进其凋亡。Zhang 等[26]发现癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）来源的外泌体通过转移miRNA-130a 而对NSCLC 细胞产生顺铂耐药，进一步研究发现，pumilio 同源物2（PUM2）是将miRNA-130a 包装成外泌体的关键因素。

PI3K/AKT 信号通路是调控外泌体miRNAs 诱导耐药的重要途径[27]。外泌体通过ncRNAs 靶向张力蛋白同源物（PTEN），通过负性调节PI3K/AKT/mTOR 信号通路与肿瘤细胞增殖、侵袭和耐药性的降低相关[28]。Dong 等[29]研究发现，缺氧NSCLC 细胞源性外泌体miRNA-21 通过下调磷酸酶和PTEN 促进顺铂耐药。另外，有研究证实癌细胞源性外泌体与肿瘤治疗中自噬现象之间可能存在的串扰。在NSCLC化疗获得性耐药中有少数研究探讨了外泌体miRNAs 作为自噬介质的作用，如来源于顺铂耐药的NSCLC 细胞的外泌体miRNA-425-3p 通过靶向AKT1/mTOR 信号通路导致自噬活性的上调，从而降低对顺铂的反应性[19]。在Ma 等[30]的一项研究中也观察到了类似的结果，外泌体miR-425-3p 通过靶向AKT1 上调自噬水平，导致治疗反应的降低，值得注意的是，顺铂通过Wnt/β-catenin/c-Myc 途径在转录水平诱导miR-425-3p 的表达。Yuwen 等[31]发现在复发率较高的晚期NSCLC 患者中，外泌体miRNA-146a-5p的水平明显低于复发率较低的患者，且在顺铂诱导的耐药过程中，癌细胞及外泌体中miRNA-146a-5p 的表达逐渐下降，miRNA-146a-5p 通过靶向自噬相关蛋白2（Atg2）抑制自噬逆转顺铂耐药。

2.2 长链非编码RNA

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）是长度超过200 个核糖核苷酸的RNA 分子，在癌症中差异表达[32]，lncRNAs 可能与DNA、RNA 或蛋白质相互作用，调节基因表达和细胞信号通路。在NSCLC 中lncRNAs 可以通过调节EGFR、IGF-1R、Wnt 等信号通路和p53 等多种途径、靶基因和miRNAs促进耐药性[33]。由外泌体转运的lncRNA 通常作为miRNAs 的竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）或调节RNA 结合蛋白发挥其调节耐药性的作用。近期，有研究证实了外泌体lncRNAPCAT-1 在NSCLC 中通过增加miR-182/miR217 的表达来调节Kras 相关的耐药，进一步研究表明，CAFs 中的外泌体PCAT-1 可触发CD133/SOX2 相关的干细胞表型，PCAT-1 基因敲除可破坏CAF 介导的间质活化并逆转化疗耐药[34]。当前对于外泌体lncRNAs 在NSCLC 获得性耐药的研究更多集中在EGFR-TKIs 等靶向药物。Lei 等[35]研究表明RNA 结合蛋白hnRNPA2B1 与lncRNA H19 相互作用，并负责将H19 包装到外泌体，转运至非耐药细胞，从而诱导吉非替尼耐药。Pan 等[36]研究发现，外泌体H19 通过miR-615-3p/ATG7 轴介导NSCLC 对厄洛替尼的耐药。此外，在厄洛替尼耐药的NSCLC 患者中，外泌体lncRNA RP11838N2.4 的血清表达水平上调，细胞外lncRNA RP11838N2.4 可整合到外泌体中并传递给敏感细胞，从而传播厄洛替尼耐药性[37]。Chen 等[38]通过体内外试验探讨NSCLC 外泌体lncRNA 尿路上皮癌相关基因1（UCA1）在吉非替尼耐药中的作用，研究表明吉非替尼耐药的NSCLC 细胞及其分泌的外泌体中UCA1 均增加，敲除UCA1 可促进miRNA-143的表达，而miRNA-143 通过调节FOSL2 的表达而发挥逆转吉非替尼耐药的作用。对于三代EGFR-TKI奥希替尼，与敏感血浆、H1975 细胞和外泌体相比，奥希替尼耐药血浆、耐药H1975R 细胞及其外泌体中lncRNA-MSTRG.292666.16 的相对表达水平显著上调，敲除lncRNAMSTRG.292666.16 可降低H1975R细胞对奥希替尼的耐药性，且耐药外泌体在敏感H1975 细胞中传递耐药性，研究还证实对奥希替尼耐药的外泌体可调控奥希替尼诱导的miRNA-21、miRNA-125b、TGF-β、ARF6 和c-Kit 等基因的表达[39]。

2.3 环状RNA

环状RNA（circular RNA，circRNAs）是一类新的RNA，来源于mRNA 前体的反向剪接，相对稳定和保守，研究表明，circRNAs 可以作为microRNA（miRNA）海绵、基因转录和选择性剪接的调节因子，与RNA 结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）相互作用，甚至可以直接翻译成蛋白质[40]。最近的研究表明[41]，circRNAs 在癌症中的作用主要依赖于ircRNAmiRNA-mRNA 调控网络，其他机制包括与RBPs 相互作用，翻译成肽或全长蛋白以及调节转录[40]。循环circRNAs 主要存在于外泌体中并通过外泌体转运，在人类血清外泌体中发现1 000 多个circRNAs，是线性RNA（linear RNA）的6 倍，表明circRNAs 较线性RNA 更容易在外泌体中富集[42]。在NSCLC 中，circRNAs 在肿瘤的发生、发展和耐药中发挥着多种作用[43]。Shao 等[44]研究表明，外泌体circ_PIP5K1A通过miRNA-101/ABCC1 轴调控NSCLC 的进展及对顺铂的敏感性，敲除外泌体circ_PIP5K1A 可抑制NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡和顺铂敏感性，miRNA-101 是circ_PIP5K1A 的直接靶点，ABCC1 是miRNA-101 的下游靶点，circ_PIP5K1A 又通过海绵状miRNA-101 正向调节ABCC1 的表达。

3 总结与展望

外泌体作为重要的细胞间信息交流的媒介，通过转运重要的核酸或蛋白质等在NSCLC 获得性耐药过程中起到了重要作用。已有的临床前研究证明了外泌体在逆转NSCLC 获得性耐药中的巨大潜力，然而，肿瘤的耐药性并非由一种或几种机制引起的，是内在（如突变）和外在（如药物失活）因素共同作用的结果，并且外泌体的内含物成分复杂，其功能也才刚刚开始被逐渐阐明，目前仍缺乏标准化的外显子分离技术、储存方法和适当的质量控制。因此，今后应集中在外泌体的精确识别和分离以及实现大规模制备治疗性外泌体的技术开发上，并进一步明确外泌体生物效应分子影响耐药性获得的关键靶分子与信号通路，为靶向治疗及利用外泌体的新型治疗提供重要的理论依据。