术前预测肝细胞癌微血管侵犯的研究进展*

周晓涵 台蕴泽 综述 周娟 审校

肝癌是世界范围内发病率第六位、死亡率第三位的恶性肿瘤[1]。其中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的类型，约占90%。研究表明外科手术是HCC 的主要治疗方式，但复发转移是影响患者术后长期生存的主要因素之一[2]。微血管侵犯（microvascular invasion,MVI）被认为是HCC 复发转移的独立危险因素，与患者不良预后密切相关[3]。但目前MVI 只能通过术后病理检查确认，若能术前预测MVI，将有助于对HCC 患者的精准治疗，提高患者生存率及筛选最佳肝移植受者。本文对术前预测HCC患者MVI 状态的相关研究及最新进展进行综述，总结了多指标联合预测模型良好的MVI 预测能力，并评估了液体活检在MVI 预测方面的较大潜力。

1 MVI 定义、发生率及其与HCC 预后的关系

原发性肝癌诊疗规范(2019年版) 中采用“七点基线取材”法对MVI 进行定义：在显微镜下于内皮细胞衬覆的血管腔（以癌旁门静脉分支为主，含包膜内血管）内发现癌细胞巢团，且无肉眼可见的肿瘤血管侵犯[4]。Rodríguez-Perálvarez 等[5]通过对20 多项研究进行系统评价，发现HCC 中MVI 的发生率介于15%～57.1%，这可能是MVI 采样标准缺乏共识导致。Yamashita 等[6]通过对414 例具有单个≤3 cm 小HCC患者进行研究，发现其MVI 阳性率达40.6%，说明即使在小HCC 患者中，也存在着显著的MVI 风险。研究表明，MVI 是影响HCC 患者预后的重要因素。Feng 等[7]根据浸润深度以及肿瘤栓子与血管壁之间的关系，将MVI 分为四种组织学类型：游离型、粘附型、侵袭型与突破型。其中前两种属于非侵袭型MVI，后两种属于侵袭型MVI；进而将患者分为M0（无MVI）、M1（非侵袭型MVI≤5）、M2（非侵袭型MVI＞5或侵袭型MVI≤5）和M3（侵袭型MVI＞5）4 类，且其总生存期依次降低。Chen 等[8]分别比较了36 项研究中单发小HCC 患者MVI 阳性组和阴性组的总生存及无疾病生存，结果表明即使对于小HCC 患者，MVI也是其预后差的危险因素。

2 MVI 状态与HCC 精准治疗

HCC 患者的治疗方案包括肝切除、肝移植、辅助治疗等。研究发现，MVI 状态与HCC 患者的术式选择、术中切缘选择及辅助治疗方案的选择相关。肝切除是HCC 患者的主要治疗方式。研究表明，对于MVI 阳性的HCC 患者，解剖学切除比非解剖学切除预后更好[9]；此外，考虑到MVI 的侵袭性、分化程度等因素，学者们提出对于合并MVI 的HCC 患者建议行肿瘤切缘较宽的切除术，以期改善患者长期预后[10]。但在一些只能选择窄切缘切除术（如肿瘤靠近肝内大血管或需要保证患者有足够的肝功能等）的情况下，患者可能会因为MVI 导致术后肿瘤早期复发，应用125I粒子植入能降低这种风险[11]。此外，“EASL 临床实践指南（2018年版）”中提出，可用射频消融（radiofrequency ablation，RFA）替代手术切除作为小HCC 患者的一线治疗方案[12]；但对于MVI 阳性的小HCC 患者，接受RFA 治疗比手术切除更易复发，不推荐RFA治疗[13]。

此外，术前预测MVI 有助于筛选最佳肝移植受者。对于符合米兰标准的HCC 患者，肝移植是一种更彻底的手术方式；但由于肝移植供体有限及存在移植后复发的问题[14]，应将器官分配给具有最佳长期生存机会的患者。研究发现，对于MVI 阳性的HCC 患者，采用解剖切除和肝移植的5年生存率相似[15]，考虑到肝移植供体有限，对此类患者应首先考虑解剖切除而非肝移植。

综上，术前预测MVI，有助于HCC 患者的精准治疗，帮助提高患者生存率及筛选最佳肝移植受者。但目前MVI 只能在术后病理检查中确认，因此，如何在术前准确预测MVI 的发生显得尤为重要。

3 术前MVI 的预测

目前，国内外学者主要从影像学、常规血清蛋白标志物、新型分子标志物等方面对MVI 进行术前预测，并致力于构建效能更高的MVI 预测模型。

3.1 影像学

先前的研究大多致力于探索肿瘤的大小、数量、边缘状态、包膜完整度等影像学特征在MVI 预测方面的意义，这在先前发表的研究[16]中已有总结，此处不再赘述。近年来，有研究深入探讨新型影像学分析技术在预测MVI 方面的价值。Cao 等[17]发现扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging，DKI）对预测HCC的MVI 和组织学分级具有重大的诊断价值。Zhu 等[18]通过对比增强磁共振成像（contrast-enhanced magnetic resonance imaging，CE-MRI）纹理分析提取了58 个特征，发现CE-MRI 纹理分析可作为预测MVI 的潜在工具。相比于传统影像学预测指标（如肿瘤边缘、包膜形成等），纹理分析可以从放射影像中自动提取定量特征，解决了影像学指标解读主观性强、可靠性差的问题。Sabaté-Llobera 等[19]通过分析HCC 患者PET/CT 图像中2-[18F]FDG 的摄取情况来识别肿瘤的组织学特征，发现病变处注射FDG 60 min 后的标准化摄取值峰值（standardized uptake value peak，SULpeak）及瘤肝比（tumor-to-liver ratio,TLR）是预测MVI的最佳参数。

3.2 常规血清蛋白标志物

目前也有研究致力于寻找预测MVI 的血清学标志物。研究表明，AFP≥200 ng/mL[20]、异常凝血酶原（DCP，又称PIVKA-Ⅱ）＞40 mAU/mL[21]可以预测MVI 的发生，但以上指标在肝硬化等患者中也可能升高，其预测MVI 发生的特异性不高。Ding 等[22]则发现血清对氧磷酶1（PON1）＜191.12 ng/mL 可以预测MVI 的发生，其曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.754；当联合PON1 和AFP 两个血清学指标预测MVI 时，其AUC 提高到0.785。

3.3 新型分子标志物

随着分子生物学技术的发展，一些新型分子标志物在MVI 预测方面的价值逐渐受到重视。微小RNA（microRNA,miRNA）是小的非编码RNA，其通过抑制信使RNA（messenger RNA,mRNA）翻译或促进mRNA 降解在转录后水平调节基因表达，在癌症的发生发展中发挥着作用。Liu 等[23]发现miR-125b 是MVI 的独立预测因素，其预测MVI 发生的特异性为51.32%，敏感性为87.50%。研究表明，血管增生与MVI 的发生密切相关[24]，低水平miR-497 可能通过影响VEGF 信号通路参与HCC 的肿瘤血管生成，进而促进MVI 的发生，但其预测MVI 的能力有待进一步研究[25]。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是转录长度超过200 nt 的非编码RNA，通过与蛋白质、RNA 或DNA 相互作用调节基因表达，促进或抑制癌症的发生发展。Lu 等[26]发现Lnc-TSPAN12 可以将HCC 中的MVI 和非MVI 患者区分开来，其AUC 达到0.855。环状RNA（circular RNA，circRNA）是真核生物中具有组织特异性和细胞特异性表达模式的共价封闭内源性RNA 分子，通过调节翻译过程或影响蛋白质功能在癌症中发挥作用。Wang等[27]则发现circSETD3 是MVI 发生的独立危险因素，其与PIVKA-Ⅱ联合预测MVI 的AUC 为0.736。

3.4 多指标联合预测模型

近年来，越来越多的研究致力于构建多指标联合预测模型对MVI 进行预测，以期提高MVI 预测的准确性。Deng 等[28]首次将NLR 纳入MVI 预测模型，并结合肿瘤大小和术前AFP 水平建立了诺模图，该模型的灵敏度和特异性分别为61.64%和71.53%；基于此模型预测的MVI 低危亚组患者，即使不符合米兰标准也可以接受肝移植。另有一些模型以影像学指标为主，赵晖等[29]研究结合瘤内动脉（动脉期或门静脉期肿瘤内部出现的非连续的、扭曲的强化动脉）、无完整瘤周高密度环影（在静脉期或延迟期包绕肿瘤的完整的、薄层的高密度环）和不规则的肿瘤边界三个因素建立了MVI 预测模型，其AUC 高达0.856；此模型的预测评分≥3 分提示MVI 高风险，推荐行解剖学切除治疗。还有研究构建了基于机器学习算法的MVI预测模型，Yao 等[30]利用基于SR 和LibSVM 的影像组学分析系统从多模式超声图像中提取了2 560 个特征并建立了影像组学模型对MVI 进行术前预测，其中SR 算法可以过滤冗余特征，有效避免过度拟合问题；LibSVM 分类器可以解决样本类别分布不均衡的问题，与之前的影像学研究相比，此模型表现出更好的MVI 预测性能（AUC=0.98）。Jiang 等[31]开发了一种整合影像组学特征（机器自动识别特征）、放射学特征（手动提取特征）和临床变量的RRC 模型和一种由单个神经网络自动提取特征和构建模型的更高效的3D-CNN 模型，这两种机器学习模型均表现出较好的MVI 预测性能，其AUC 分别达到0.887 和0.906。其中，相比于依赖专家定义进行特征提取的RRC 模型，3D-CNN 模型只需输入图像即可实现MVI 的智能识别，有利于MVI 最佳预测模型的构建，并节约了人力物力资源。

综上，现阶段已经涌现出大量的MVI 预测指标，但目前这些指标尚存在较多不足：1）目前研究涉及的MVI 预测指标的准确度尚未达到临床要求，亟需找到灵敏度高、特异性好的新型MVI 预测标志物。2）现有预测指标及其阈值大多由单一机构研究确立，样本量不足且缺乏临床实践检验，需要更多外部验证并检验其可靠性。3）不同预测模型纳入的预测因素各不相同，难以相互比较，且部分影像学指标的判读主观性较强，难以进行标准化。

4 液体活检在MVI 预测方面的潜在价值

目前尚未找到灵敏度高、特异性好的MVI 预测标志物，加之HCC 具有较高的肿瘤异质性[32]，进一步增大了寻找可靠预测MVI 标志物的难度。近年来液体活检的发展为肿瘤诊断带来了巨大机遇，它是指从人体体液（如血液、尿液、唾液和脑脊液等）中获取疾病信息的技术，其检测对象主要包括循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞和外泌体，具有快速、简便、无创伤、实时动态的优势，且可以克服肿瘤异质性[33]。

4.1 循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指外周血中存在的带有肿瘤特异性的遗传或表观遗传学改变的DNA 片段，无创易得且术前即可通过外周血富集得到。已有研究表明，肿瘤细胞DNA 突变可以赋予肿瘤细胞更强的侵袭能力[34]，且理论上发生血管侵犯后ctDNA 更易检出[35]，加之ctDNA 突变可以克服肿瘤异质性及与HCC 肿瘤组织突变具有良好的一致性[36]，能够更加全面地反映HCC 肿瘤基因组的全貌，提示其是一种极具潜力的MVI 预测标志物。Wang 等[35]发现术前ctDNA 阳性及术后ctDNA 突变等位基因频率（mutant allele frequency，MAF）升高与MVI 的发生有关，但该研究仅纳入四个热点突变，可能会导致检出率较低，且无法全面反映肿瘤相关基因和通路在MVI 发生中的潜在作用机制。Wang 等[37]通过对术前外周血和术中肿瘤组织中1 021 个与实体瘤相关的基因进行靶向深度测序，证实ctDNA 等位基因频率（allele frequency，AF）与MVI 的相关性。以ctDNA AF＞0.83%为临界值来预测MVI 的发生，其灵敏度达78.6%，特异度达81.8%，但此研究为中等队列研究，亟需扩大样本量对研究结果进行验证。

4.2 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是在肿瘤发生过程中由原发肿瘤或转移灶脱落释放入外周血的肿瘤细胞，可以直观反映出患者体内活体肿瘤细胞的特性。已有研究表明，CTC 与HCC 不良预后和术后复发转移相关，有学者进一步探索了CTC 与HCC MVI 之间的关系。Zhou 等[38]发现术前CTC 数量≥5 个/5 mL 是HCC 中MVI 发生的独立预测因素，且其预测MVI 发生的能力（AUC=0.856）比AFP（AUC=0.636）和肿瘤直径（AUC=0.604）的预测能力更高。He 等[39]则发现，当CTC 数量≥3 个/3.2 mL 时，其预测HCC 中MVI 发生的AUC 值达到0.857，进一步将其纳入包含AFP、DCP、CTC、最大肿瘤直径和肿瘤边缘不光滑度5 个指标在内的MVI 预测模型中，其灵敏度和特异性分别达到86.49% 和90.20%。现阶段CTC 已经表现出较好的HCC MVI 预测价值，但尚缺少高灵敏度的CTC 检出方法[40]，CTC 在MVI 预测中的作用仍需进一步探索。

4.3 外泌体

外泌体是体内几乎所有细胞（包括肿瘤细胞）分泌的一类包含多种生物分子,如mRNA、miRNA、lncRNA 和蛋白质等在内的细胞外膜性囊泡，含量丰富，且其磷脂双层膜可以保护外泌体内容物不被降解，稳定性高，是极具潜力的肿瘤诊断标志物。外泌体可被附近或远处的细胞吸收后发挥调节作用，在重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）、免疫调节反应和肿瘤转移等方面有着重要作用[41]。有研究表明，外泌体可以促进HCC 的生长和侵袭转移[42]。Chen 等[42]研究发现外泌体可以实现高转移性MHCC97H 细胞和低转移性HCC 细胞之间的通讯交流，从而增加低转移性HCC 细胞的侵袭转移能力。Li 等[43]发现外泌体中存在的LOXL4 可以通过FAK/Src 途径和促进HCC 血管生成来促进HCC 的肝内转移。因此推测，外泌体也可能是一种极具潜力的MVI 预测标志物，但目前尚无相应研究，其价值有待挖掘。

值得注意的是，现阶段液体活检在预测MVI 发生中的相关研究主要涉及血液中相关标志物，尚无研究探索血液以外的其他体液（如唾液、尿液等）中的MVI 预测标志物。已有研究证实了唾液中lnc-PCDH9-13:1、尿液中TP53突变及RASSF1A和GSTP1异常甲基化在预测HCC 发生和复发中的作用[44-45]，但唾液和尿液中是否存在预测MVI 发生的可靠标志有待进一步研究。

5 总结与展望

目前术前预测HCC 中MVI 的研究已经取得很大进展，但仍存在一些问题亟需解决：1）MVI 采样方法尚无国际统一标准[46]。由于MVI 发生位置不确定，采样方法不规范会导致MVI 漏检，影响MVI 研究结论的可靠性。2015年之前，尚无针对HCC MVI 检测的采样指南，也很少有报道阐述MVI 检测的病理采样过程，直到2015年，在中国发布的原发性肝癌病理诊断的实践指南中才明确提出了MVI 检测的“七点基线采样法”[47]，但该指南目前仅应用于中国[46]，仅在一些大型医院得到执行，且该采样方法的可靠性尚未得到验证，其具体实施仍有待落实。2）缺乏大样本验证和多中心研究：现阶段关于MVI 预测的研究大多是单一机构研究，样本量不足且缺乏临床实践检验，需要更多外部验证检验其可靠性。3）现有研究探索的部分相关指标并不能特异性预测MVI，提示整体恶性程度高[20,22]，仍需要进一步寻找与MVI 直接相关的特异性指标。4）MVI 预测对HCC 精准治疗的应用价值仍需探索：目前MVI 仅能通过术后病理检查确认，因此现阶段MVI 状态与HCC 术式选择仍处于回顾性研究阶段。MVI 预测对指导HCC 精准治疗的真实临床价值，还需在建立起可靠的MVI 术前预测模型的基础上进行前瞻性研究。

目前已发现大量指标与MVI 有关，但仍难以准确预测MVI，新型分子预测标志物尤其是液体活检的出现及基于机器学习算法建立模型对术前预测MVI提供了可行的思路。未来还需进一步规范MVI 采样、探索MVI 新标志物、联合新标志物构建预测性能更好的预测模型并进行多中心验证，前瞻性评价其临床应用价值。