抗PD-1 单抗联合顺铂的新辅助治疗策略对NSCLC 人源化小鼠模型肿瘤复发与转移的影响

李惠 郭文文王荟荟 秦靖张彩勤赵菊梅∗师长宏∗

(1.延安大学基础医学院,陕西 延安 716000;2.空军军医大学实验动物中心,西安 710032;3.甘肃中医药大学基础医学院,兰州 730030)

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,2020 年全球新发肺癌患者约220 万例,死亡180 万例,其中NSCLC 占比为80%～85%[1]。早期和部分晚期NSCLC 的治疗以根治性手术为主,手术虽能带来一定的控制效果,但局部复发和远处转移率高达30%～55%[2-3]。因此,寻找有效减少术后风险的围手术期治疗方案是当前可切除NSCLC 治疗亟待解决的问题之一。

新辅助化疗是指在实施局部治疗方法(如手术)前所做的全身治疗[4]。手术前进行基于铂类的新辅助化疗是早期NSCLC 临床常用治疗策略,与单纯手术相比,新辅助化疗能够改善患者的围手术期状况,包括降低肿瘤分期,提高完全切除率和消除微转移灶等。但Felip 等[5]发现无论是术前新辅助化疗还是术后辅助化疗,较单纯手术相比,NSCLC的5 年生存率仅能提高约5%。另一方面,以免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)为代表的免疫治疗极大改善了包括NSCLC 在内的多种肿瘤的治疗效果[6],且ICIs 与化疗的结合能够进一步扩大晚期NSCLC 的获益人群[7-8]。鉴于免疫治疗与化疗联合治疗的成功应用,能否将这种联合治疗方案应用于可切除NSCLC 的新辅助治疗值得关注。目前,关于新辅助ICIs 联合化疗的最优治疗方案以及对术后复发转移的直接影响尚未有研究报道,其对肿瘤免疫微环境的影响也未充分阐明。且近年来新辅助免疫治疗研究使用的模型都是鼠源性实验[9],缺乏说服力。因此,采用能够模拟人体肿瘤免疫微环境的临床前动物模型来进行新辅助联合治疗的研究显得至关重要。

通过在重度联合免疫缺陷小鼠中移植人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),进而重建人的免疫系统,获得Hu-PBMC(Humanized-peripheral blood mononuclear cells) 模型,在ICIs 评估方面具有独特的应用前景[10]。本研究在成功构建Hu-PBMC 模型的基础上,进一步移植人的NSCLC 细胞,构建了免疫系统-肿瘤双人源化非小细胞肺癌移植模型,然后进行了顺铂、帕博利珠单抗以及二者联合的新辅助治疗研究,以期为NSCLC 的临床新辅助治疗提供有效策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40 只4～7 周龄SPF 级雌性重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt,NCG),体重(22 ± 2)g,购自成都药康生物科技有限公司【SCXK(川)2020-034】。室温(22 ± 2)℃,相对湿度40%～70%,明暗交替,光照12 h/12 h,饮用水经过高压蒸汽灭菌,自由饮水、摄食,饲养于空军军医大学实验动物中心SPF 级屏障设施【SYXK(陕)2019-001】。相关动物实验获得了空军军医大学实验动物福利伦理委员会批准(No.19013)。

1.1.2 细胞

人非小细胞肺癌细胞株H1299 购买于ATCC,并通过慢病毒转染标记荧光素酶(H1299-luc),保存于本实验室。该细胞培养于RPMI-1640 培养基(10%胎牛血清+1%青链霉素),于37℃、5% CO2孵育箱中培养。

1.1.3 主要试剂与仪器

新鲜外周血取自空军军医大学第一附属医院输血科,并获得医学伦理委员会批准(KY20 193035);胎牛血清、RPMI-1640 培养基和0.05%胰酶购自美国Gibco 公司;人Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084 sterile solution 试剂购自美国GE Healthcare;小鼠淋巴细胞分离液试剂购自中国天津市灏洋生物科技有限公司;抗人流式检测抗体:FITC-CD45 抗体、PE-CD3e 抗体购自美国BD Biosciences 产品;IHC 试剂盒购自康为世纪有限公司;抗人CD45、CD8、Ki67 和GzmB 抗体购于美国Abcam;顺铂购自中国齐鲁制药有限公司;帕博利珠单抗购自美国默沙东公司。流式细胞分析仪FC500 购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人源化NSCLC 小鼠模型的构建及鉴定

采用Ficoll 密度梯度离心法提取不同供体的新鲜PBMC,通过尾静脉注射入小鼠体内,细胞量为每只1 × 107PBMC。PBMC 移植2 周后,将对数生长期的H1299-luc 细胞系接种于小鼠皮下,细胞量为每只5 × 106个H1299-luc 细胞。移植3 周后采用剪尾法取重建小鼠静脉血,并分离出PBMC,加入抗人CD3+T 细胞、CD45+免疫细胞荧光抗体进行标记,采用流式分析评估重建小鼠外周血中人免疫细胞的比例,FlowJo 10 软件进行数据分析。

1.2.2 免疫组化染色检测小鼠肝、肺、脾以及肿瘤中人免疫细胞的比例

CO2安乐死重建小鼠和未重建小鼠,收集其肝、肺、脾以及肿瘤组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,制备组织切片,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复后,滴加一抗(抗人CD45 和抗人GzmB),4℃孵育过夜。次日滴加二抗,DAB 显色后苏木精复染,经梯度乙醇与二甲苯脱水后封片,光学显微镜采图,并用 Image-Pro Pus 软件进行定量分析。

1.2.3 新辅助治疗策略

H1299-luc 皮下移植后,每周2 次动态监测小鼠肿瘤体积ab2/2(a 为长径,b 为短径),在皮下肿瘤达到150～200 mm3时,将小鼠随机分为4 组,每组10 只,并开始新辅助治疗:(1)对照组,PBS,静脉注射,5 d 2 次;(2)新辅助帕博利珠单抗组,20 mg/kg,静脉注射,5 d 2 次;(3)新辅助顺铂组,3 mg/kg,腹腔注射,5 d 2 次;(4)新辅助帕博利珠单抗联合顺铂组,同时给药,用药剂量及次数同上。

1.2.4 免疫荧光观察肿瘤组织中CD45+T、CD8+T浸润情况

将肿瘤组织用多聚甲醛溶液固定,并进行石蜡包埋切片,经脱蜡覆水、抗原修复、BSA 封闭后,孵育一抗Anti-CD45 抗体、Anti-CD8 抗体、DAPI 进行细胞核染色,4℃孵育过夜后加入荧光二抗,避光孵育1 h,加抗荧光衰减剂封片后置4℃保存,荧光显微镜下观察拍片,并用Image-Pro Pus 软件进行定量分析。

1.2.5 小动物活体成像系统(invivoimaging system,IVIS)

治疗结束后,通过切除小鼠的皮下原发肿瘤来模拟临床手术以及观察术后肿瘤的复发与转移。小鼠腹腔注射200 μL 15 mg/mL 荧光素(luciferin),经过异氟烷气麻后仰卧放入成像暗箱平台,采用IVIS 系统(Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA)进行光学成像,其生物发光强度用光子p/(sec·cm2·sr)表示。待小鼠出现明显衰竭症状后处死小鼠,解剖观察各脏器转移灶,并立即用IVIS 检测离体组织中的肿瘤转移灶信号。使用了版本为Living Image 4.7.3 软件获取和分析数据。

1.3 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计学分析,结果用平均值±标准差()表示。两组间比较采用非配对t检验法进行差异分析,P<0.05 为具有统计学意义;多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建人源化的非小细胞肺癌小鼠模型

本实验免疫系统-肿瘤双人源化模型的构建策略如图1A 所示。人新鲜外周血中的PBMCs 移植3周后检测小鼠外周血中人CD45+CD3+T 细胞含量,如图1B 所示,来自不同供体的不同小鼠外周血中CD45+CD3+T 细胞比例不同,大于25%时标志着免疫系统人源化小鼠构建成功[10]。免疫组化结果如图1C,未重建小鼠脾、肝、肺以及肿瘤中没有免疫细胞浸润,而免疫系统重建小鼠的脾,肝、肺以及肿瘤中均有hCD45+免疫细胞浸润,其中脾中hCD45+免疫细胞浸润最为明显,说明人免疫细胞可以浸润小鼠各脏器以及肿瘤中。

图1 免疫系统人源化小鼠模型的构建及鉴定Note.A.Construction strategy of immune system-tumor dual-humanization model.B.The proportion of CD3+CD45+T cells in peripheral blood of different mice.C.IHC of hCD45+cells in liver,lung,spleen and tumor of mice.Figure 1 Construction and identification of humanized mouse model of immune system

2.2 新辅助联合治疗能够明显抑制术后肿瘤的复发和转移

模型构建成功后,新辅助治疗策略如图2A 所示。新辅助治疗结束后连续成像至术后第12 天,顺铂组较对照组无显著性差异(P>0.05),帕博利珠单抗单药组荧光信号弱与对照组、顺铂单药组;与帕博利珠单抗单药组相比,联合治疗组信号更弱(P<0.05),如图2B,2C。IVIS 成像及肉眼观察术后第12 天的小鼠肝、肺,结果如图2D,2E,联合治疗组中小鼠的肝、肺转移灶的数量明显少于与对照组中小鼠的肝、肺转移灶的数量,与上述的活体成像结果一致。说明新辅助联合治疗能够明显抑制术后的脏器转移。

图2 新辅助治疗后复发与转移情(n=5)Note.A.Neoadjuvant treatment strategy.B.IVIS every four days.C.Quantification of mouse IVIS fluorescence signal.D.IVIS imaging of mouse liver and lung.E.Gross appearance of mouse liver and lung,small circle for metastasis foci.Figure 2 Recurrence and metastasis after neoadjuvant treatments(n=5)

2.3 新辅助治疗对肿瘤Ki67 的影响

免疫组化结果如图3A,3B,四组小鼠肿瘤组织中Ki67 表达的比较,有统计学意义(P<0.05)。顺铂单药组肿瘤组织Ki67 表达与对照组小鼠无显著性差异(P>0.05);帕博利珠单抗单药组小鼠肿瘤组织Ki67 表达低于对照组、顺铂组(P<0.05),联合治疗组肿瘤组织Ki67 表达较帕博利珠单抗单药组降低更加显著(P<0.05),说明联合治疗能够显著抑制肿瘤细胞的增殖。

图3 新辅助免疫治疗后肿瘤组织Ki67 的变化(n=5)Figure 3 Changes of Ki67 in tumor tissue after neoadjuvant immunotherapy(n=5)

2.4 新辅助治疗对肿瘤组织中CD45+免疫细胞、CD8+T 以及Granzyme B 的影响

肿瘤组织免疫荧光染色结果如图4A,4B,4 组小鼠肿瘤组织中CD45+免疫细胞、CD8+T 浸润数量的比较,具有统计学意义(P<0.05)。顺铂组小鼠肿瘤组织中hCD45+免疫细胞、CD8+T 细胞浸润与对照组无显著性差异(P>0.05);帕博利珠单抗单药组小鼠肿瘤组织中hCD45+免疫细胞、CD8+T 细胞浸润高于对照组(P<0.05),与顺铂联合治疗后肿瘤组织中hCD45+免疫细胞、CD8+T 细胞浸润更加明显(P<0.05)。GzmB 是CD8+T 淋巴细胞杀伤靶肿瘤细胞过程中最主要的效应分子,肿瘤组织免疫组化染色结果显示(如图4C,4D),4 组小鼠肿瘤组织中GzmB 表达的比较,具有统计学意义(P<0.05)。顺铂组小鼠肿瘤组织中GzmB 与对照组无显著性差异(P>0.05);帕博利珠单抗单药组小鼠肿瘤组织中GzmB 高于对照组(P<0.05),与顺铂联合治疗后肿瘤组织中GzmB 更加明显(P<0.05)。说明联合治疗能够促进免疫细胞向肿瘤组织中浸润并杀伤肿瘤细胞。

图4 新辅助免疫治疗后肿瘤免疫微环境的变化(n=5)Figure 4 Analysis of tumor immune microenvironment after neoadjuvant treatments(n=5)

3 讨论

本研究成功构建了人源化NSCLC 小鼠模型,研究了新辅助免疫联合化疗对手术后复发与转移的影响,进一步分析了其潜在的免疫机制,这与Liu等[11]的研究结果一致,即新辅助疗法的应用对原发性肿瘤切除后的远处转移具有显著的抑制作用。与已报道的实验不同,本研究创新性的使用了人源化小鼠作为新辅助免疫治疗的动物模型,因而能够测试临床常用的免疫检查点抑制剂的治疗效果。另一方面,目前正在进行的关于NSCLC 新辅助治疗的Ⅰ/Ⅱ期单臂临床试验的终点事件主要是手术标本的完全病理缓解(CR)、部分病理缓解(PR)以及主要病理缓解(MPR)等[12-13],缺乏对新辅助治疗术后复发转移的直接观察。同时,利用IVIS 活体成像动态观察了小鼠术后的复发转移情况,能够更加直观准确地评价新辅助治疗的效果。本研究获得的新辅助免疫治疗小鼠模型不仅限于评估免疫治疗的效果,还可进一步用于筛选预测新辅助效果的生物标志物,优化术前的治疗方案,揭示新辅助免疫治疗的机制以及评估不同免疫治疗的联合策略。

文献报道,免疫检查点抑制剂联合化疗的新辅助治疗策略能够改善肿瘤免疫微环境[14]。本研究发现帕博利珠单抗联合顺铂抗肿瘤效果的增强是由于肿瘤组织中CD8+T 细胞的广泛浸润,并促进CD8+T 细胞分泌GzmB 杀伤肿瘤细胞。研究证实,ICIs 在免疫抑制的“冷肿瘤”中无效,其特征在于缺乏T 细胞浸润;而T 细胞浸润丰富的“热”肿瘤与良好的ICI 疗效密切相关[15]。本研究发现,构建的NSCLC 人源化移植肿瘤属于免疫抑制的“冷”肿瘤,基于免疫治疗联合化疗的关键策略是将其转化为“热”肿瘤。Correale 等[16]建立了MC38 结肠肿瘤小鼠模型,顺铂与抗PD-1 抗体和抗PD-L1 抗体联合给药,发现联合治疗CD8+T 细胞的数量高于对照组,机制是通过CXCL9/CXCL10/CCL5)轴促进T 细胞浸润。同时,研究报道,术前新辅助化疗增加了CD8+T 和GzmB 浸润,改善了卵巢癌的临床结局[17]。本研究发现,帕博利珠单抗联合顺铂治疗组肿瘤组织中出现了大量的CD45+免疫细胞、CD8+T浸润,与对照组和单药治疗相比有显著差别,提示“冷”肿瘤向“热”肿瘤转化,并且促进CD8+T 的效应分子颗粒酶B 的分泌,从而增强了抗肿瘤效果。此外,化疗杀伤肿瘤细胞后能够释放大量肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen,TSA)[18];同时,化疗进而促进I 类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex-I,MHC-I)上调,使TSA 向CD8+细胞毒性T 细胞的呈递[19-20]。PD-1/PD-L1 抑制剂可以通过重新激活T 细胞的功能发挥抗肿瘤作用[21]。总之,新辅助免疫治疗联合化疗能够通过上述机制共同发挥作用来增强抗肿瘤效果。

本实验采用移植人新鲜外周血中的PBMCs 构建hu-PBMC 模型,其操作简单、免疫系统重建速度快,是进行免疫检查点抑制剂评估常用的人源化动物模型[10]。该类模型重建的免疫系统以人的T 细胞为主,适合各种T 细胞相关的免疫疗法的评估。但是Hu-PBMC 模型缺乏重建的人B 细胞和NK 细胞等免疫亚群。因此在后续实验中,我们将利用人CD34+造血干细胞构建的人源化小鼠模型[22],进一步研究其他免疫亚群在联合治疗中的作用。

总之,本研究发现帕博利珠单抗联合顺铂新辅助治疗可以显著增加肿瘤中CD8+T 细胞浸润以及GzmB 的分泌,提示新辅助免疫治疗联合化疗可增强免疫检查点抑制剂的治疗效果,有效抑制NSCLC的局部复发与远处转移。