石豆兰杂交种无菌播种技术研究

田海娟，邹婉霞，郝静静，欧阳勤森，卓书斌，马洪洋

（东莞植物园，广东 东莞 523086）

石豆兰属（BulbophyllumThouars）是兰科（Orchidaceae）最大的一个属，约有2 200种，主要分布于亚洲、南美洲、非洲等热带地区[1]。我国约有105种，广泛分布于贵州、广西、云南和福建等地[2]。该属植物大部分的假鳞茎呈圆形，顶端长有一枚单叶，形态特征明显，其株形优美，具有很高的观赏价值和市场前景。有些全草或假鳞茎皆可入药，具有润肺止咳、养胃生津、清热化痰、滋阴降火、抗癌、抗肿瘤等功效[3-5]，具有一定的药用价值。由于石豆兰种子胚胎发育不充分，不含胚乳，在自然条件下很难萌发[6]，而传统的繁殖方式如分株繁殖等繁殖系数低、生长速度缓慢，远远无法满足市场需求。通过人工组织培养技术，可以在短期内获得大量的优质种苗供市场所需，而目前我国针对石豆兰属组织培养方面的研究报道较少，因此，建立石豆兰属植物组织培养繁殖技术体系尤为重要。本研究通过人工杂交种的无菌播种，再经过增殖培养，可在短期内获得大量的组培苗以供栽培，亦可为石豆兰快速繁殖提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材以石豆兰品种‘Bulbophyllumpingtungense’为父本，‘Bulbophyllumfascinator var.corazonae’为母本，在东莞植物园兰花棚培养开花后，经人工授粉150 d后所得的成熟蒴果。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条件 设置培养箱的温度为（24±2）℃，光照强度2 000～2 500 lx（暗培养阶段除外），光照时间12 h·d-1。

1.2.2 种子消毒及无菌播种 采集未开裂的成熟蒴果，在实验室内先用洗洁精水洗去蒴果表面附着的杂质，再置于流水下冲洗约10 min，注意水流不宜太大，以免冲破蒴果表皮。提前打开超净工作台开紫外灯和风机，灭菌20 min，然后将种子移至超净工作台上，先用75%的酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗3次，之后用0.1%的升汞消毒10 min，期间适当晃动瓶身以保证种子消毒均匀且彻底，再用无菌水反复冲洗5～7次，将其放至在灭过菌的滤纸上，吸干蒴果表面多余的水分，用灭菌的解剖刀切掉蒴果两端（注意不要切到种子的部分），最后纵向切开蒴果，用镊子夹取粉末状的种子，利用手腕的抖动均匀的撒播在培养基上。

种子萌发所选用的培养基为：①1/2MS；②1/2 MS+活性炭1 g·L-1；③1/2MS+土豆汁100 g·L-1+活性炭1 g·L-1。土豆汁的制备方法：新鲜土豆削皮，称取100 g用榨汁机搅碎后加到1 L的培养基溶液中。以上培养基均添加蔗糖30 g·L-1、琼脂粉7.6 g·L-1，设置pH值5.8。先置于暗环境下进行培养，待种子开始膨大后再转入光条件下继续培养，培养45 d后观察种子萌发情况。

1.2.3 芽的增殖 将已分化出嫩芽的原球茎转接到添加了不同激素的培养基中进行培养，培养基以MS为基础培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA（表1），每组均添加蔗糖30 g·L-1、琼脂7.6 g·L-1、活性炭1 g·L-1，设置pH值5.8，每组处理分别接种10瓶，每瓶接种10个芽，重复3次。培养50 d后观察并统计不同培养基中芽的增殖情况。

表1 石豆兰芽的增殖培养基

1.2.4 生根壮苗培养 待原球茎分化出的小苗具有1～2片健壮叶片、高约2 cm时转接到生根壮苗培养基上进行成苗培养，培养基以1/2MS为基础培养基，添加不同浓度的NAA和IBA（表2），每组均添加蔗糖30 g·L-1、琼脂粉7.6 g·L-1、活性炭1 g·L-1，设置pH值5.8。培养一段时间后，确定最优培养基，然后在最优培养基中添加土豆汁100 g·L-1（表2）。培养60 d后，每组处理随机选择30瓶，观察不同培养基中幼苗的生根壮苗情况，统计生根率、平均根数及平均株高等生长指标。

表2 石豆兰成苗培养基

1.3 数据统计分析

试验数据采用SPSS Statistic 28.0和WPS软件进行处理分析。平均出芽数＝总芽数/接种数；生根率＝产生根的植株数/接种数×100%；平均生根数＝总根数/接种数。

2 结果与分析

2.1 不同添加物对石豆兰种子萌发的影响

由图1可知，本试验所选用的3种培养基对石豆兰种子的萌发效果差异明显。在培养基③中，播种30 d后，种子开始膨大变白形成球状胚，培养60 d后，胚体继续膨大并变绿形成原球茎，同时自顶部开始长出叶片；在培养基②中，石豆兰杂交种子也可正常萌发，但其萌发时间晚、萌发数量少，形成的原球茎不如培养基③中的原球茎浓绿、膨大，有部分种子失活甚至死亡的现象发生；在培养基①中，种子培养60 d后只有极少数种子萌发，其形成白色球状胚后生长速度开始变缓，甚至死亡，萌发率低。由本试验可知，一定量的活性炭和土豆汁对石豆兰种子的萌发均有影响，当同时添加土豆汁100 g·L-1、活性炭1 g·L-1时的萌发效果最好，能够有效的加快石豆兰种子生长发育和原球茎的形成，且形成的原球茎健壮、浓绿。因此，本试验中适于石豆兰杂交种子萌发的培养基为：1/2MS+土豆汁100 g·L-1+活性炭1 g·L-1。

图1 不同培养基中石豆兰种子萌发情况

2.2 不同激素配比对石豆兰芽增殖的影响

将已分化出芽的原球茎转接到添加了不同激素的培养基上进行增殖培养，由表3可知，不同浓度的6-BA和NAA对石豆兰杂交种芽的增殖效果差异显著，当NAA浓度不变，6-BA浓度在0.5～1.0 mg·L-1范围内时，平均出芽数随着6-BA浓度的增大呈上升趋势；当6-BA浓度为1.0 mg·L-1、NAA浓度为0.5 mg·L-1时，平均出芽数为9.2个，达到最大；6-BA浓度和NAA浓度继续升高时，平均出芽数开始降低。处理4中原球茎分化出的小苗长势好、颜色浓绿、苗体健壮，少量小苗已有根系产生（图2）。综合可知，本试验中石豆兰杂交种芽的增殖最适宜的培养基为MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+活性炭1 g·L-1。

表3 不同激素组合对石豆兰杂交种芽增殖的影响

图2 处理4中石豆兰杂交种芽的增殖情况

2.3 激素和有机物对石豆兰生根壮苗的影响

将分化形成的具有完整叶片的小苗转移到壮苗生根培养基中进行成苗培养，观察培养60 d后的生根情况。由表4可知，NAA和IBA的浓度为0.5 mg·L-1时，石豆兰杂交种幼苗的生根率较低，只有35.33%，此时植株弱小，叶色黄绿；当NAA浓度不变、IBA浓度在0.5～1.0 mg·L-1时，随着浓度的升高，石豆兰杂交种幼苗的生根率、平均根数和平均株高均表现出显著性差异；就NAA而言，对石豆兰杂交种的生根率和平均根数的影响呈先促进后抑制，而当NAA和IBA浓度为1.0 mg·L-1时，平均株高为4.38 cm，此时石豆兰杂交种出现了少量增殖情况，植株细长；当NAA浓度为0.5 mg·L-1、IBA浓度为1.0 mg·L-1时，石豆兰杂交种幼苗的生根率为91.67%，在此基础上添加100 g·L-1的土豆汁，石豆兰杂交种的生根率达到100%、平均根数为3.88条、平均株高为4.18 cm，此时幼苗生根壮苗情况最好，其叶片宽大质厚，颜色浓绿、植株健壮、根系多而粗壮（图3）。综合可知，本试验中石豆兰杂交种壮苗生根最适宜的培养基为：1/2MS+NAA0.5 mg·L+IBA1.0 mg·L-1+活性炭1 g·L-1+土豆汁100 g·L-1。

图3 不同培养基中石豆兰杂交种组培苗的生根壮苗情况

表4 不同激素和有机物对石豆兰杂交种组培苗生根的影响

3 结论与讨论

目前关于石豆兰组织培养的相关研究和文献报道非常少，本研究开始前查阅了兰科其他属植物无菌播种技术的相关研究成果，并在试验初期种子的消毒方式、不同阶段培养基的选择以及播种初期的培养条件等方面进行了参考。陈和明等[7]、张月娇[8]、林榕燕等[9]在对兰花种子进行消毒时都用了70%～75%的酒精（30～60 s）和0.1%的升汞（10～20 min）的处理方式。经综合考虑，本研究对石豆兰种子的消毒方式为：先用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒10 min，最后用无菌水冲洗5～7次，试验结果显示种子未发生污染现象，由此可知，运用此方式对石豆兰杂交种子进行消毒是可行的。

兰科不同属植物在无菌播种阶段适宜培养基大不相同，本研究以1/2MS培养基为基础培养基，以土豆汁和活性炭作为对照，结果表明，3种培养基均可诱导种子萌发，以添加活性炭1 g·L-1和土豆汁100 g·L-1的培养基萌发效果最佳。这与林榕燕等[9]、刘扬等[10]、赖金莉等[11]对杂交兰（Cymbidium hybrid）、兜唇石斛（Dendrobium aphyllum）和建兰（Cymbidium ensifolium）的研究结果相似，而与张月姣[8]、张小娟等[12]对墨兰（Cymbidium sinense）的研究结果存在差异。原因可能是不同属的种子在萌发时对无机盐、糖类、有机物质以及植物生长调节剂的要求有所不同。

很多兰科植物在播种初期需要先进行一段时间的暗培养，再转入光下培养，本研究依照此方法对石豆兰杂交种子进行培养，其作用可能是部分兰花种子萌发时要求较低水平的远红光吸收型光敏色素（Pfr）[13]，以及暗培养可以减少组培外植体的褐化情况[14]，从而促进种子的萌发。

植物激素对芽的增殖具有重要的调控作用，黄崇成等[15]对石豆兰鳞芽进行增殖时发现，以MS为基础培养基，附加6-BA 0.4 mg·L-1、NAA0.2 mg·L-1增殖效果最好；李洪林等[16]在对广东石豆兰（Bublophyllumkwangtungense）进行增殖培养时，所用激素配比以6-BA 2.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1为最佳，增值系数可达4～5倍。本研究在石豆兰芽的增殖阶段以MS为基础培养基，以添加不同浓度的6-BA和NAA作为试验对照。结果表明，不同处理均可诱导出芽，在添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和活性炭1 g·L-1的培养基中增殖效果最好，平均出芽数达到9.2个，这与黄崇成等[15]和李洪林等[16]的研究结果相似，也与部分近缘属石斛兰（Dendrobium）的增殖类似[17-18]。

本研究中，通过在种子萌发阶段添加活性炭对比发现，适宜浓度的活性炭能够促进种子萌发，其作用可能是活性炭能够吸附培养基中的一些营养物质以及代谢过程中产生的废弃物，从而促进种子的形态发生和器官形成[19]，因此在增殖培养阶段也添加了活性炭；而在生根培养阶段添加活性炭，其作用可能是在培养基底部形成一个比较暗的局部环境，促进根系的生长和发育，从而达到生根壮苗的目的[10]。

相关研究表明，适宜浓度的有机添加物可促进兰花种子萌发，在成苗阶段可以促进幼苗叶片增大增厚和根系的发生，通常可选择椰汁、土豆汁和香蕉汁等有机物。王汪中等[20]的研究结果表明，添加7.5%的土豆泥可有效地提高杜鹃兰（Cremastra appendiculata）种子的萌发率；席刚俊等[21]研究发现，在白芨（Bletilla striata）种子萌发培养基中添加200 g·L-1的土豆泥，萌发率可达（83.47±3.11）%；许丁帆等[17]的研究结果表明，添加50 g·L-1的土豆泥对玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）的生根壮苗影响显著。由于土豆汁价格便宜且易获得，因此，本研究以添加土豆汁为对照对石豆兰杂交种不同阶段的培养进行探讨。结果表明，在添加1 g·L-1活性炭和100 g·L-1的土豆汁的共同作用下，石豆兰杂交种子的萌发效果最好；在生根壮苗阶段添加100 g·L-1的土豆汁能够有效地促进根系的分化和幼苗生长，这是由于土豆汁中的各种维生素、糖类、有机物质和矿物质等微量元素提供给组培苗生长发育所需要的各种养分，同时能够提高组培苗在弱光环境下的碳代谢的能力，从而促进幼苗的壮苗和生根[22]。