基于熵权法结合Box-Behnken响应面法优化天钩平肝复方提取工艺

尹贤敏，范润勇，徐 伟，蒲立立，张 明，钟佰明，周 茜

（南充市中医医院 药学部，四川 南充 637000）

高血压（hypertension）病属中医学“眩晕”“头痛”等范畴[1]，是以体循环动脉压增高为主要临床表现的综合性疾病，是由复杂和关联病因引起的一种进展性心血管综合征，也是心脑血管病的第一危险因素[2]。高血压发病率高、危害大，是心肌梗死、脑卒中、心力衰竭及慢性肾脏病等慢性非传染性疾病的重要危险因素，已成为全球重大公共卫生问题[3]。同时，高血压易合并其他疾病，现已成为影响人类健康的第一大疾病[4]，具有较高的致残率和致死率，给社会带来沉重负担[5]。肝阳上亢证是高血压病最常见的中医证型[6]，与其他中医证型相比，其发生靶器官损害的程度可能会显著增加[7]。

“天钩平肝汤”为我院省名中医徐仕宏主任中医师的经验方，该方来自天麻钩藤饮加减并结合了泽泻汤而成，由天麻、钩藤、石决明、罗布麻叶、酒黄芩、栀子、葛根、酸枣仁、首乌藤、川芎、白术、泽泻等药味组成。该方以天麻钩藤饮加减配合泽泻汤，以平抑肝阳结合渗湿利尿，即平肝降压结合利尿降压，用于治疗肝阳上亢型高血压等引起的眼花、震颤、失眠、头痛、眩晕、耳鸣。由于该方未进行系统性研究，本研究按照“三小、五方便”的原则，拟将其研发为颗粒剂，并采用高效液相色谱（HPLC）法，以天麻素、栀子苷、黄芩苷、葛根素及固体总量为评价指标，考察提取次数、提取时间、加水倍数，采用熵权法（信息熵法）分析各指标的权重系数，结合Box-Behnken设计-响应面法结果优化天钩平肝复方的最佳提取工艺参数，为临床提供安全、有效、便捷的中药制剂品种。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AUW220D分析天平（日本岛津公司）；FA2004分析天平（上海力辰科技仪器有限公司）；G-100S型超声波清洗器（深圳市哥能清洗设备有限公司）；SHZ-D（III）型循环水真空泵（上海力辰科技仪器有限公司）；RE-1102型旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司）；SYG-4型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器厂）；WGL-45B型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；LCK2000煎药机（天津三延精密机械有限公司）。

1.2 试药

栀子苷（批号：110749-201919，纯度：97.1 %），葛根素（批号：110752-201816，纯度：95.4 %），天麻素（批号：110807-201306，纯度：96.8 %），黄芩苷（批号：110715-202122，纯度：94.2 %，中国食品药品检定研究院）；天麻（批号：200501），钩藤（批号：210601），酒黄芩（批号：200501），石决明（批号：201201），栀子（批号：200401），酸枣仁（批号：201201），首乌藤（批号：210401），毛冬青（批号：191201），泽泻（批号：200501），葛根（批号：201201，成都吉安康药业有限公司）；罗布麻叶（批号：C364210701），红花（批号：201201，成都欣福源中药饮片有限公司）；川芎（批号：210617），合欢皮（批号：210519，四川和顺康药业有限公司）；白术（批号：D202109002A，四川香雪制药有限公司）。本研究所用中药饮片经南充市中医医院张德明中药师鉴定。乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 天钩平肝复方提取

取天麻约10 g，酒黄芩约15 g，栀子约15 g，葛根约30 g等全部处方药味，加水适量，煎煮提取数次，每次提取1.5 h，提取液浓缩至500 ml。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备 取2.1项下浓缩后提取液，摇匀，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加纯水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 阴性对照样品溶液制备 分别称取缺天麻、栀子、酒黄芩、葛根的天钩平肝复方处方，按2.2.1项下方法分别制备缺天麻、栀子、酒黄芩、葛根的阴性样品溶液。

2.2.3 对照品溶液制备 分别取栀子苷、葛根素、黄芩苷、天麻素适量，置50 ml量瓶中，加50 %甲醇溶液至刻度，配制成浓度分别为86.4，591.48，500.1，101.4 μg/ml的对照品溶液，即得。分别精密量取上述栀子苷对照品溶液4.34 ml，葛根素对照品溶液1.50 ml，黄芩苷对照品溶液5.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇，配制成含栀子苷15 μg/ml、葛根素35.5 μg/ml、黄芩苷100 μg/ml的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱Agilent Zorbax SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）；温度 25 ℃；流速1 ml/min。天麻素：以乙腈-0.1 %磷酸（5:95）为流动相；检测波长为220 nm；进样量为10 μl；理论板数按照天麻素峰计算应不低于5000。栀子苷、葛根素、黄芩苷：以乙腈-0.1 %磷酸为流动相，梯度洗脱：0～18 min，13 %乙腈；18～30 min，13 %～27 %乙腈；30～45 min，27 %乙腈；检测波长238 nm，进样量2 μl；理论塔板数按栀子苷计算应不低于1500。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取不同浓度的天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷对照品溶液，按2.3项下色谱条件进行检测，以峰面积积分值（Y）对进样浓度（X，μg/ml）进行线性回归分析，各对照品的回归方程、相关系数和线性范围分别为：天麻素：Y=0.0326X+0.0388（R2=1.0000），线性范围为25.35～304.9 μg/ml；栀子苷：Y=0.0453X+0.0024（R2=1.0000），线性范围为3.75～45.00 μg/ml；葛根素：Y=0.0684X+0.0012（R2=1.0000），线性范围为5.91～106.50 μg/ml；黄芩苷：Y=0.0221X+0.0748（R2=0.9999），线性范围为5.01～30.00 μg/ml。结果显示，天麻素、栀子苷、葛根素、黄芩苷在相应浓度范围内，线性关系良好。

2.4.2 系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论板数按天麻素和栀子苷峰计算应分别不低于5000和1500，分离度应不小于1.5，拖尾因子应在0.95～1.05之间。

2.4.3 专属性考察 分别取供试品溶液、混合对照品溶液、天麻素对照品溶液，缺天麻、栀子、葛根、酒黄芩阴性对照溶液各2 μl，按2.3项下色谱条件进行检测，结果见图1、图2。结果显示，供试品溶液HPLC图谱中与对照品溶液色谱在相同保留时间有对应峰，证明其专属性强。

图1 天钩平肝复方混合对照品HPLC图谱

图2 天钩平肝复方天麻素对照品HPLC图谱

2.4.4 精密度考察 取混合对照品和天麻素对照品溶液，连续进样或检测6次，结果栀子苷、葛根素、黄芩苷和天麻素对照品色谱峰峰面积的RSD分别为0.2 %，0.17 %，0.66 %，0.25 %，均小于1 %，表明仪器精密度较高。

2.4.5 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h 6个时间点进行检测，结果栀子苷、葛根素、黄芩苷色谱峰峰面积的RSD分别为0.78 %，0.44 %，1.40 %，均小于2 %，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 重复性考察 按2.2.1项下方法，平行制备6份供试品溶液，按2.3项下色谱条件检测。结果栀子苷、葛根素和黄芩苷峰面积的RSD值分别为2.78 %，1.08 %，1.57 %，均小于3 %，表明此方法重复性好。

2.4.7 加样回收试验 取已知含量的样品溶液6份，按2.2.1项下方法制成供试品溶液，精密加入对照品溶液适量，按2.3项下色谱条件进样检测，计算加样回收率。栀子苷、葛根素、黄芩苷、天麻素的加样回收率平均值分别为99.79 %，101.06 %，99.17 %，99.92 %，RSD分别为1.21 %，1.53 %，1.64 %，2.95 %，表明方法准确度良好。

2.5 固体总量测定

按固体总量测定法[《中国药典》（2020年版）通则3101[8]]测定天钩平肝复方的固体总量。

2.6 天钩平肝复方提取工艺优化

2.6.1 Box-Behnken设计试验方案 在前期单因素试验的基础上，以提取次数（A）、提取时间（B）、加水倍数（C）为考察因素，各因素选取低、中、高3个水平，分别以-1、0、1编码表示，以栀子苷、葛根素、黄芩苷、天麻素及固体总量为评价指标，按Box-Behnken设计试验方案（表1）进行提取。

表1 Box-Behnken设计因素与水平表

2.6.2 熵权法对数据的分析 信息熵是系统不确定性和无序程度的度量，除了度量数据包含的信息量，还可用于在多指标评价系统中确定各指标权重。该法是将每个评价指标作为 1 个随机变量，计算该指标的熵权系数，其取值变异程度越大，越无序，提供的信息量越多，该指标重要性越高。根据熵权法确定权重的计算步骤[9-10]，计算出栀子苷、葛根素、黄芩苷、天麻素、固体总量信息熵（Hi）值分别为0.9843，0.9863，0.9868，0.9776，0.9962，Hi值越大不确定性越大，包含的信息越多，熵权系数（Wj）分别为0.2282，0.1999，0.1914，0.3255，0.0550，Wj值越大其权重越大，其值总和为1，因此天麻素的权重最大。

2.6.3 Box-Behnken设计试验结果 按2.3项下色谱条件测定栀子苷、葛根素、黄芩苷和天麻素，按2.5项下方法测定固体总量，采用熵权法进行权重评分，计算公式为：综合评分=（栀子苷含量/栀子苷含量最大值×0.2282+葛根素含量/葛根素含量最大值×0.1999+黄芩苷含量/黄芩苷含量最大值×0.1914+天麻素含量/天麻素含量最大值×0.3255+固体总量/固体总量最大值×0.0550）×100 %，结果见表2。

表2 Box-Behnken设计试验结果

2.6.4 Box-Behnken设计模型拟和及方差分析 运用Design Expert 8.0.6软件，拟合栀子苷、葛根素、黄芩苷、天麻素和固体总量的综合评分（Y）对A、B、C 3个因素的多元二次回归模型，结果证明模型具有极显著性差异（P＜0.01），回归模型较优。最终得到多元二次回归方程为：Y=-553.3038+88.3788A+123.7525B+85.4588C+0.4150AB-2.1275AC+1.7050BC-13.3688A2-45.1750B2-4.0791C2，拟合方程调整后的R2为0.9062，表示此模型拟合程度良好，可用此模型对提取工艺进行预测、分析。方差分析结果表明，A、A2、C2对综合评分（Y）的线性效应有极显著影响（P＜0.01），B2对综合评分（Y）的线性效应有显著影响（P＜0.05）。由试验结果可知，此模型拟合有极显著性（P＜0.01），且失拟项P＞0.05，说明实测值和预测值之间无失拟存在，误差较小，说明此模型具有较好的预测性[11]。各因素对天钩平肝复方提取工艺影响的主次顺序为提取次数＞加水倍数＞提取时间，结果见表3。

表3 响应面二次模型的方差分析

2.6.5 最佳提取工艺的优化预测 根据拟合方程，采用Design-Expert软件，优化预测天钩平肝复方提取工艺的最佳条件，绘制二次回归方程等高线及3D响应曲面图，用于评价3个因素之间的交互强度[10]，确定天钩平肝复方最佳的提取工艺，见图3。预测得天钩平肝复方最佳提取工艺为提取次数2.32次、提取时间1.57 h、加水倍数10.15倍，根据实际生产，最终优化的天钩平肝复方提取工艺为提取次数2次、提取时间1.5 h、加水倍数10倍。

图3 响应面图及等高线图

2.7 验证试验

按预测的最佳提取工艺，即提取次数2次、提取时间1.5 h、加水倍数10倍，平行3次试验，按2.2.1项方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样检测，最终3次验证试验的综合评分为88.92，89.34，89.78，平均评分为89.35，RSD值为0.4813 %。由此可知，优化后的工艺稳定性较好、重复性较高，表明所建立的数学模型具有良好的预测性。

3 讨论

天钩平肝复方治疗由肝阳上亢、风阳上扰、水饮内停所致，证属本虚标实，而以标实为主，治以平肝熄风为主，佐以清热安神、利水除饮之法，临床疗效确切，患者依从性较好，具有开发利用价值。

本文采用熵权法结合Box-Behnken设计[12-13]优化了天钩平肝复方提取工艺，其中熵权法可用于多指标评价，具有科学合理性，星点设计-效应面法也常用于中药复方的提取工艺研究。通过预试验、Box-Behnken设计结合响应面法试验和验证试验，确定了天钩平肝复方最佳提取工艺为提取次数2次，提取时间1.5 h，加10倍量水。优化后的天钩平肝复方提取工艺稳定性高、重复性好、利于批量生产，可为天钩平肝颗粒成型工艺研究奠定基础。