保山香料烟功能组分的提取分离与应用

蒋美红，李 仙， 弓新国， 吴长伟， 黄志强， 吴明美， 普兴伟， 张 勃， 郑 琳

(云南斯莫特生物技术有限公司， 云南 昆明 650106)

0 引言

【研究意义】近年来，烟草制品的发展环境发生了重大而深刻变化，烟草制品结构正朝着多样化和无烟化的方向调整[1-4]。近十年，新型烟草在欧、美、日等发达国家迅速崛起并发展，国际烟草业巨头纷纷进入新型烟草市场[5-6]。在我国，新型烟草制品同样取得了快速发展。但由于新型烟草制品不直接参与燃烧，卷烟的抽吸感受远远不及传统卷烟，存在烟味变淡、香气减弱、卷烟产品失去原有风格等品质缺陷。因此，提高烟气浓度和香味、提升口感、彰显风格成为卷烟工作者亟待解决的问题。香料烟(Oriental tabacco)是生产混合型卷烟的重要原料，云南保山的香料烟品质优良，仅次于希腊、土耳其的香料烟，充分挖掘其功能组分在新型烟草中的应用意义重大。【前人研究进展】我国香料烟生产开发趋于种植规模化和加工产业化，理论和应用技术研究不断深入，烟叶质量显著提高，部分指标已接近或达到国际优质烟水平[7]。赵铭钦等[8-10]研究了香料烟浸膏提取的工艺条件，并分析其在混合型和烤烟型卷烟中的应用效果以及在香料烟浸膏中检测出包括脂肪酸类、酯类、氮硫杂环类和醛类共21种香气成分。【研究切入点】关于香料烟提取物作为烟用香料的研究主要集中在烤烟型和混合型卷烟中，鲜见其用于新型烟草的研究报道。【拟解决的关键问题】以保山香料烟为原料，通过超声波辅助萃取，采用响应面进行提取工艺条件优化获得粗提物，再利用膜分离得到高品质功能组分，研究其应用于新型烟草的作用效果，为保山香料烟开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟叶 保山香料烟选自2019年云南保山市的一类烟叶。

1.1.2 试剂 95%乙醇(工业级，市售)；石油醚(工业级，市售)；无水硫酸钠(AR，广东汕头市西陇化工厂)；二氯甲烷(AR，天津市博迪化工有限公司)。

1.1.3 仪器 超声波萃取装置(济宁奥超电子设备有限公司)，AB204-S型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，ZNHW型电热套(巩义市英峪予华仪器厂)，自制抽滤装置；SHZ-1型循环水式真空泵(巩义市英峪豫华仪器厂)，LABOROTA-4000型旋转蒸发仪(德国HEIDOLPH公司)，YP2001N型电子天平(0.1 g，上海精密科学仪器有限公司)，KBF240恒温恒湿箱(德国BINDER公司)，TG/DSC1型热重/差热综合热分析仪(瑞士Mettler Toledo公司)，Agilent 7890A/5975c气相色谱/质谱联用仪(美国 Agilent公司)，Pyroprobe 5250T型热裂解仪(美国CDS公司)，GERSTEL冷进样系统(德国GERSTEL公司)，防爆型超滤试验机(1812型，北京清大漠科膜技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 保山香料烟初提物制备 保山香料烟粉碎后置于圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙醇，超声提取，收集提取液；残渣部分采用相同的方法再次提取，收集第2次提取液，合并2次提取液过滤，滤液减压浓缩，即得初提物。

1.2.2 初提物制备工艺优化 按照1.2.1方法，运用 Design Export中Box-Behnken试验设计[11]，选取乙醇提取浓度A(50%、70%和95%)、提取温度B(40℃、50℃和60℃)和提取时间C(30 min、45 min和60 min)3个因素，以感官评价分值为响应值，进一步考察不同提取因素对初提物品质的影响，确定最佳工艺条件。

以感官得分(Y)为指标，以乙醇浓度(A)、提取温度(B)和提取时间(C)为因素，按照响应面法的Box-Behnken Design(BBD)试验方案进行3因素3水平15个试验点的响应面试验(表1)，15个试验点中包括12个析因点(1～12)及3个中心点(13～15)，中心点重复的目的是估计纯试验误差，以感官分值Y作为响应面分析的响应值[11-12]。

表1 响应面试验因素与水平

1.2.3 功能组分的分离纯化 将初提物稀释30倍后充分搅拌，冷冻分离后抽滤，滤液进行膜分离，根据试验结果调整温度、操作压力等参数。

1.2.4 常规化学成分含量测定 提取物中的总糖及还原糖、总植物碱、总氮、淀粉、蛋白质含量按烟草行业标准参考《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》(YC/T 159—2002)、《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》(YC/T 160—2002)、《烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》(YC/T 161—2002)、《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》(YC/T 216—2007)、《烟草及烟草制品蛋白质的测定连续流动法》(YC/T 249—2008)利用连续流动分析仪测定。

1.2.5 致香成分检测 致香成分按照烟草行业标准参考《烟草及烟草制品致香成分的测定同时蒸馏萃取-气相色谱质谱联用法》(TCJC-ZY-Ⅳ-014-2012)利用气质联用仪测定。

GC-MS分析测试条件：色谱柱HP-5MS(60 m×0.132 mm×0.125 μm)，载气为He，流速1 mL/min，进样温度240℃，接口温度250℃，质谱扫描范围35～455 m/z，离子源为EI源，电子能量70 eV。按此分析测试条件，对挥发性成分进行GC-MS分析，各化合物质量分数的确定为面积归一化法。化合物定性分析是根据GC-MS联用所得质谱信息经计算机用Wiley、NISt 98谱库与标准谱图对照、解析，确认其中的化学成分。

1.2.6 热重分析方法 样品分析前，设置热重分析仪在800℃条件下保持10 min，以排净炉体内杂质。热天平灵敏度为 1 μg，以空坩埚为参比物。称取(5.00±0.05)mg典型加热不燃烧卷烟烟草材料置于热重铂坩埚内，在 80 mL/min空气流量下，升温程序以10℃/min速率由30℃升至800℃后保持10 min。

1.2.7 热裂解试验条件及分析方法

1) GC-MS条件。利用GC/MS，设置色谱质谱条件：毛细管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度240℃；载气为He；流速1 mL/min；GC-MS接口温度250℃；升温梯度为50℃保持1 min后以2℃/min速度升至100℃保持1 min，然后以8℃/min速度升至260℃保持5 min；离子源为EI源；电子能量为70 eV；扫描范围35～455 m/z；标准图谱库为NIST、WILEY谱库。

2) 热裂解条件。新型烟草电加热温度低于350℃，因此试验在50～350℃进行热裂解研究。利用PYROPROBE 2000，设置条件：初始温度30℃，升温速率20.00℃/ms，裂解温度350℃，持续时间10 s，裂解氛围为10%氧气、大气环境或氮气(气体流量：2.5 mL/s)。

3) 固相微萃取条件。当香原料与添加剂、对照(空白，无添加剂)在大气环境中进行热裂解时，采用黑色萃取头从自行设计的裂解瓶中对裂解产物进行萃取，萃取时间为10 min、温度为70℃，然后将SPME进样针头插入气相色谱高温汽化室中进行解吸附，时间为2 min。

4) 热裂解试验方法。称取约2 mg样品加入裂解专用石英管中，然后将石英管置于热裂解仪的加热丝中，在不同裂解氛围中的350℃下进行热裂解，固相微萃取头置于自行设计的裂解瓶中对裂解产物进行萃取，时间为10 min、温度为70℃，之后将SPME进样针插在气相色谱的高温汽化室中进行解吸附，时间为2 min，裂解产物进入气相色谱/质谱(GC/MS)进行分离与鉴定，进行标准谱库检索，若不特别说明裂解产物的匹配度均大于60。

2 结果与分析

2.1 初提物制备工艺优化

2.1.1 最佳萃取条件 运用Design Expert 8.0.6对表2响应面试验设计及感官得分进行多元回归拟合，得感官分值与各因素的二次多项式回归模型：

Y=-1.30+0.64A+2.48B-0.25C-5.56×10-3AB+5.19×10-3AC+8.33×10-3BC-4.40×10-3A2-2.22×10-2B2-5.44×10-3C2

由图1可知，该二次回归方程模型极显著(P=0.0004<0.01)，同时模型的决定系数为0.961 1，表明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此模型进行预测分析。在选取因素水平范围内，各因素对结果的影响为提取温度(B)>乙醇浓度(A)>提取时间(C)。一次项A(P=0.0140<0.05)、B(P=0.0002<0.01)和C(P=0.0449<0.05)差异显著或极显著，说明乙醇浓度、提取时间对保山香料烟初提物感官分值有显著影响，提取温度有极显著影响。二次项A2、B2和C2均达显著或极显著水平，说明提取温度、乙醇浓度和提取时间对感官分值的影响不是线性关系。AC交互项差异极显著(P<0.01)，AB、BC交互项差异显著(P<0.05)，说明3个因素的交互作用对保山香料烟初提物感官分值有显著影响。

表2 响应面试验的感官得分

2.1.2 最佳萃取条件 通过Design Expert 8.0.6对回归方程求解，在试验因素水平范围内预测超声波萃取的最佳条件为乙醇浓度67.44%、提取温度57.11℃、提取时间52.64 min。为方便生产操作，将微波萃取的最佳条件修正为乙醇浓度65%、提取温度55℃、提取时间55 min。采用优化后的最佳提取工艺：样品粉碎后置于圆底烧瓶中，加入8倍65%乙醇，在55℃条件下用超声提取55 min，收集第1次滤液，残渣部分采用相同的方法再次提取，收集第2次提取液，合并滤液后提取率为45.61%。

2.2 功能组分的分离纯化

经多次试验考察，采用分子量为10 000～30 000超滤膜、3 000～5 000超滤膜，在室温、操作压力为0.16～0.18 MPa条件下进行分离精制，将分离物减压浓缩至密度指标为1.250 0±0.008半流体。由表3可见，通过膜分离后的提取物得率有所降低，嗅香略有改变。经过分子量为3 000～5 000超滤膜分离后，初提物品质有明显改善，应用于新型烟草中吸味改善明显，刺激性略有，烟香丰富性提升。因此，选择分子量为3 000～5 000超滤膜进行分离，得到保山香料烟功能组分。

表3 保山香料烟初提物与膜分离精制物收率、外观、嗅香及感官评吸

2.3 功能组分的应用

2.3.1 常规化学成分 由表4看出，经过膜分离后，各成分含量均有不同程度的变化，功能组分的总糖、淀粉和蛋白质较初提物降低，分别降低16.07%、20.83%和43.64%，而还原糖、烟碱和总氮变化较小，经过膜分离后仍保留。

表4 保山香料烟初提物及功能组分的常规化学成分

2.3.2 致香成分 由图2可见，初提物及功能组分致香成分对比，通过膜分离后美拉德反应物含量增加，苯丙氨酸类降解产物、类西柏烷类降解产物和类胡萝卜素类降解产物变化较小，新植二烯略有降低。总体来说，通过膜分离后较好地保留了提取物中的功能性成分。

2.3.3 新型烟草中的热重 由图3可知，添加功能组分的样品与对照相同，热失重均分为4个阶段，且热失重较大的均在第2、第3阶段，在第2失重阶段，失重比较剧烈，DTG曲线上有较大峰；在第3失重阶段，失重最为剧烈，DTG曲线上呈大的尖峰。对照在第1阶段失重温度区间为50～237℃，添加了功能组分的样品为100～210℃，从第2阶段起添加功能组分的样品热失重温度较对照有所提前，且加入功能组分的样品在第2、第3阶段热失重比达65%，而对照为54%。说明，加入功能组分后能改变新型烟草烟气生成状态，主要的热失重集中于新型烟草加热温度区间，有利于提升吸食舒适性。

2.3.4 新型烟草中的热裂解 由图4可见，由于裂解温度较低，检测物质相对较少，其中对照共检测出20种物质，主要为糠醛(18.24%)、5-甲基-2-糠醛(6.33%)、烟碱(5.96%)等；添加功能组分的样品共检测出34种物质，主要为糠醛(12.94%)、烟碱(9.21%)、5-甲基-2-糠醛(6.77%)、4-环戊烯-1,3-二酮(5.21%)。可见，加入功能组分能增加新型烟草烟气丰富性，从而提高其感官品质。

3 讨论

采用响应面优化法确定最佳提取工艺已有广泛的研究报道[11-12]，而对最佳工艺得到的成分进行膜分离精制尚未见报道。该研究为便于对比分析，依据中性香气物质的前体物特征，将经过膜分离后的香气物质中主要的香气成分分为美拉德反应物、苯丙氨酸类降解产物、类西柏烷类降解产物、类胡萝卜素类降解产物和新植二烯共五大类[13]。该研究分析发现，美拉德反应物含量有增加，美拉德(Maillard)反应是烤烟香气成分形成的重要过程之一。在烟叶调制过程中，氨基酸可直接与糖类物质发生非酶棕色化反应，形成特有浓郁香气的阿马杜里(Amadori)化合物，该反应产物是构成加工食品和烟草等香味成分的重要来源。苯丙氨酸类降解产物、类胡萝卜素降解产物及类西柏烷类降解产物变化小，烟草中苯丙氨酸类致香物质能产生典型的杏仁香、樱桃香、甜香、玫瑰花香、醇香等清爽香气，是烟草中含量较丰富的香味成分。类胡萝卜素致香物质是构成烟叶香气质量的重要组分，其中，巨豆三烯酮、β-大马酮、法尼基丙酮等物质含量较大，是形成烤烟细腻、高雅和清香的主要成分，其产生的香味阈值相对较低，对烟叶香气质量的贡献率大。类西柏烷类致香物质主要存在于烟叶的角质层上，是烟叶腺毛分泌物的主要成分，以茄酮及其衍生物为主。茄酮具有香气，而且可转化为茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等香味物质[14]。将功能组分应用于新型烟草后进行热失重和热裂解分析发现，加入功能组分能改变新型烟草烟气生成状态，在低温条件下热裂解产物增多，这也与感官评吸的吸味改善明显、烟香丰富性提升相吻合。

4 结论

采用响应面优化法确定保山香料烟最佳提取工艺以及膜分离最佳工艺参数，产品得率为37.64%，将膜分离精制得到的功能组分应用于新型烟草中能明显改善吸味，提升烟香丰富性；分离精制后的功能组分总糖、蛋白质和淀粉含量大幅下降，烟碱、还原糖和总氮变化较小，主要致香物质得到较好保留；加入功能组分后能改变新型烟草烟气生成状态，主要的热失重集中于新型烟草加热温度区间，有利于提升吸食舒适性；加入功能组分能明显增加新型烟草烟气丰富性。该提取分离工艺可从保山香料烟中获取能改善新型烟草吸食效果的功能组分。