威宁短柱油茶MKK3基因克隆及生物信息学分析

郑庆梅， 徐嘉娟， 杨 冰， 霍 达， 朱亚艳， 许 杰， 王 港*

(1.赤水市木司国有林场， 贵州 赤水 564700； 2.贵州省林业科学研究院， 贵州 贵阳 550005)

0 引言

【研究意义】威宁短柱油茶(CamelliasaluenensisStapf.)为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)的常绿灌木或小乔木[1-3]。其株形紧凑，树姿优美，花色艳丽，可作为园林观赏树种；同时，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄，抗逆性强，出籽率高，种仁含油率高，油质优等特性，是优良的木本食用油料树种。因此，威宁短柱油茶具有很高的经济价值，是支撑贵州省西部高寒山区林业产业发展的优良树种之一。对其在长期适应高寒山区环境过程中形成的抗逆机制进行研究，有利于用基因工程技术手段改善油茶的抗性和适应性。对威宁短柱油茶MAPKK基因家族成员进行分离克隆，可为进一步研究威宁短柱油茶该基因家族的功能、挖掘威宁短柱油茶抗逆相关基因奠定基础。【前人研究进展】外界环境胁迫下，植物信号转导通路主要有丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联途径、Ca2+依赖信号转导通路、Ca2+依赖的盐过敏感信号通路和ABA信号转导通路4种类型[4-5]。MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在真核生物中高度保守[6]。MAPK级联途径由丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK/MEKK)-丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK/MEK/MKK)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)3种功能上连续作用的蛋白激酶组成[7-9]，MAPKKK位于整个反应的上游，可受Ras、Rho等信号激活，进而通过磷酸化下游的MAPKK将信号传递，被激活的MAPKK同样磷酸化并激活下游的MAPK，从而完成信号的传递，调控下游基因的表达，进而参与植物的生长发育、生物胁迫及非生物胁迫响应[6,9-12]。已有研究表明，植物中MAPK在生长发育、非生物胁迫响应、激素信号传导及防御反应中发挥重要作用。YDA-MKK4/MK5-MPK3/MPK6级联在RGF1-RGI配体-受体对的下游和PLT1/PLT2的上游发挥作用，调节拟南芥中的干细胞数量和初生根生长[13]；MKK4/MKK5-MPK3/MPK6级联在调控植物侧根形成过程中具有关键作用[14]；OsMKK10-OsMKK4-OsMAPK6信号通路正调控水稻的粒径和重量[15]；ZmMKK4是植物耐盐耐寒性的正向调节因子[7,16]；拟南芥AtMEKK1-MKK2-MPK4/6级联通路可提高盐胁迫耐受性[17]；过表达玉米ZmMKK1基因可提高转基因烟草对低温胁迫的抗性[17]。【研究切入点】目前，对威宁短柱油茶的研究主要集中在生物学特性、资源分布、良种选育、栽培技术等方面，对其分子生物学方面的研究尚少，不能充分挖掘其资源优势。【拟解决的关键问题】克隆分离威宁短柱油茶MAPKK基因家族相关基因，获取MKK3基因全长cDNA序列并进行生物信息学分析，为今后开展该基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料于2020年3月采自贵州省毕节市威宁彝族回族苗族自治县花果山油茶示范基地。选取长势良好的威宁短柱油茶植株，采集盛花期无病虫害、发育正常的花蕾，取样后立即液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。

1.2 基因克隆

取威宁短柱油茶花蕾，利用RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取总RNA，通过反转录合成cDNA第1链(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，-20℃保存备用。根据前期试验得到的威宁短柱油茶MKK3基因序列，利用Primer 6.0设计特异性引物，正向引物5′TTAGTGGAGCTGTTAAGATGGT3′，反向引物5′ACAAAGGTCCCTTGGATGAG3′，进行PCR扩增，扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。回收扩增产物，转入大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆测序。

1.3 生物信息学分析

利用生物信息学软件(表1)对获得的威宁短柱油茶MKK3基因编码的氨基酸序列、蛋白质基本理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构、系统进化关系等进行分析。

表1 生物信息学分析软件

2 结果与分析

2.1 威宁短柱油茶MKK3基因的克隆及序列

以威宁短柱油茶花蕾RNA反转录的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得威宁短柱油茶MKK3基因cDNA序列全长2 219 bp(图1)。根据NCBI保守结构域预测(图2)，该基因编码的蛋白含有1个MAPKK保守结构域，因此，推测该基因属于MAPKK基因家族，并在NCBI数据库进行BLAST比对，发现该基因与茶(Camelliasinensis)、木薯(Manihotesculenta)和橡胶树(Heveabrasiliensis)的mitogen-activated protein kinase kinase 3(MKK3)基因具有较高的相似性，相似度分别为99.23%、89.00%和88.80%，将其命名为CsMKK3。

2.2 威宁短柱油茶MKK3蛋白的基本理化性质

根据NCBI的ORFfinder预测结果，CsMKK3基因包含1个1 557 bp的开放阅读框，以ATG为起始密码子，TAG为终止密码子，位于398～1 954 bp，编码518个氨基酸。利用ExPasy Prot Param对编码的蛋白进行理化性质分析表明，蛋白的相对分子量为57 524.61 Da，理论等电点为5.44，氨基酸组成中亮氨酸(Leu)含量最高，为10%，酸性氨基酸残基(Asp, Glu)63个，碱性氨基酸残基(Arg, Lys)48个，亲水性平均值为-0.162，不稳定指数42.83，该蛋白为不稳定蛋白。

2.3 威宁短柱油茶MKK3蛋白的亲疏水性、跨膜结构及信号肽

由图3可见，CsMKK3蛋白第71位氨基酸残基的亲水性最强，亲水性值为-2.60，第269位氨基酸残基的疏水性最强，亲水性值为2.044。蛋白质亲水区域多于疏水区域。因此，推测CsMKK3蛋白为亲水性蛋白。对CsMKK3蛋白的跨膜结构及信号肽进行分析表明(图4～5)，该蛋白不存在跨膜结构，不存在信号肽酶切位点，属于非分泌型蛋白。

2.4 威宁短柱油茶MKK3蛋白的亚细胞定位及磷酸化位点

对CsMKK3蛋白的亚细胞定位预测发现，该蛋白定位于细胞核。由图6可见，对CsMKK3蛋白的潜在磷酸化位点进行分析发现，该蛋白存在63个特异性激酶位点，包括28个丝氨酸(S)磷酸化位点、15个苏氨酸(T)磷酸化位点、10个酪氨酸(Y)磷酸化位点。根据植物蛋白激酶分组，CsMKK3蛋白特异性激酶有AGC组的以cAMP(环腺苷酸)依赖的蛋白激酶PKA、cGMP(环鸟苷酸)依赖的蛋白酶PKG、钙和磷脂依赖的蛋白激酶PKC及蛋白激酶B(PKB)等14种；属于CMGG组的p38MAPK、cdc2、GSK3和cdk5等。

2.5 威宁短柱油茶MKK3蛋白的二级结构与三级结构

经SOPMA分析表明(图7)，α螺旋(Alpha helix)和无规则卷曲(Random coil)是CsMKK3蛋白二级结构的主要成分，均占比38.42%，另外伴有17.37%的延伸链(Extended strand)和5.79%的β转角(Beta turn)。利用SWISS-MODEL在线软件预测威宁短柱油茶CsMKK3的三级结构(图8)，该蛋白的主要空间结构由α螺旋和无规则卷曲构成，与二级结构预测结果一致。

2.6 威宁短柱油茶MKK3蛋白的互作关系

对CsMKK3蛋白与相关蛋白的互作网络预测分析表明(图9)，CsMKK3蛋白与MAPK蛋白激酶家族的MPK2、MPK14、MPK1、MPK8、MPK5、MPK7、MPK6等蛋白存在相互作用，这些蛋白均为MAPK级联途径中被MAPKK激活的下游蛋白激酶。MKK处于MAPK信号传导途径中间位置，而其在MAPK相关基因家族中基因数目最少，可以与多个MAPK反应，从而形成多个准确、特定的信号通路。

2.7 威宁短柱油茶MKK3蛋白的系统进化

由图10可见，威宁短柱油茶CsMKK3和茶MKK3(Camelliasinensis, XP_028069657.1)的遗传距离最近，聚类为同一小支，而后与洋蓟MKK3(Cynaracardunculusvar. Scolymus, XP_024981482.1)和小蓬草MKK3(Erigeroncanadensis, XP_043632042.1)以及河岸葡萄MKK3(Vitisriparia, XP_034707953.1)聚类为一大类。大戟科的3种植物聚为一类，蔷薇科的4种植物聚为一类，锦葵科的4种植物和锦葵目木棉科的榴莲聚为一类，十字花科的拟南芥单独聚为一类且与其他科植物的距离较远，说明MKK3基因具有较高的保守性。

3 讨论

植物在进化过程及整个生命周期中，特别是对不利条件的抵御，形成了复杂有效的防御机制，并在分子水平、细胞水平和生理水平等方面对各种信号作出响应，从而维持正常的生长和发育[9,18]。MAPK级联是抗逆途径的重要信号传导途径之一，在植物对各种生物和非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6级联在拟南芥免疫信号途径中发挥重要作用，赋予拟南芥对细菌和真菌病原体的抗性[18]；MAPKKK18-MAPKK3-MAPK1/2/7/13/14参与拟南芥干旱胁迫调控[19]；过表达ZmMKK3的转基因烟草植株抗氧化能力明显改善[20]。MAPKK(MKK)位于MAPK级联系统的中心位置，是接受上游信号刺激并激活下游信号的枢纽，已有研究表明，拟南芥中有10个MKK基因，水稻中有8个MKK基因，玉米中有9个MKK基因[9,11-12,18]。

亚细胞定位预测表明，CsMKK3蛋白定位于细胞核，而茶CsMAPKK3和玉米ZmMKK3均定位于细胞质和细胞核中[21]。研究表明，MAPKK在细胞的各亚细胞区域均有分布，玉米ZmMKK4、拟南芥AtMKK9定位于细胞核中发挥功能，拟南芥AtMKK4在细胞质中发挥作用，油菜(Brassicanapus) BnMKK2、BnMKK3和BnMKK4同时存在于细胞质和细胞核中，拟南芥AtMKK7和AtMKK9在细胞核、细胞质和细胞膜上均有分布[17]。CsMKK3蛋白不存在信号肽和跨膜结构，属于非分泌蛋白，蛋白质的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。BLAST比对发现，CsMKK3蛋白与茶MKK3和木薯MKK3蛋白的相似性分别为99.23%和89.00%，结构域分析发现，CsMKK3蛋白包含1个MAPKK保守结构域，推测其属于MAPKK家族成员。系统进化分析发现，威宁短柱油茶CsMKK3与茶MKK3遗传距离最近，与洋蓟、小蓬草和河岸葡萄聚在一大类，而与其他植物遗传距离较远，总体上不同植物MKK3蛋白的聚类与植物系统分类相一致。蛋白互作分析表明，MKK3与MPK2、MPK7及MPK14等相互作用从而参与信号传导。

磷酸化是植物体内常见的蛋白质翻译后修饰，蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程参与植物温度胁迫、盐胁迫、干旱胁迫、养分胁迫和激素调控等代谢和生理途径[22]。MAPKKK、MAPKK(MKK)及MAPK组成的MAPK级联通过逐级的磷酸化完成信号传递，对威宁短柱油茶MKK3基因磷酸化位点的预测分析为其功能研究提供参考。

4 结论

研究从威宁短柱油茶花蕾中克隆获得1个MAPKK基因(CsMKK3)，ORF长1 557 bp，编码518个氨基酸，蛋白的相对分子量为57 524.61 Da，理论等电点5.44，是无跨膜结构和信号肽的不稳定蛋白，亚细胞定位、磷酸化位点、蛋白互作等预测及系统进化分析均表明其符合MAPKK基因家族特征。对威宁短柱油茶MKK3基因的克隆分离及生物信息学分析，可为进一步研究其功能及深入挖掘威宁短柱油茶抗逆相关基因提供参考。