火龙果水提物对皮肤的安全性及体内抗氧化性评价

方晓彤， 杨 虹， 王 宇， 穆 波， 王前菊， 周俊良*

(1. 贵州省果树科学研究所， 贵州 贵阳 550006； 2. 贵州中医药大学 基础医学院，贵州 贵阳 550002)

0 引言

【研究意义】近年来，贵州省火龙果种植面积和产量迅速增加，紫红龙是其主要栽培品种之一[1]。火龙果为仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereus)植物果实，是一种热带和亚热带气候水果[2]。火龙果富含维生素和氨基酸、酚类物质等[3-4]，以其色泽好和口感佳受到消费者的欢迎。但由于受产期短、贮藏性较差和肉质纤维容易老化等因素的限制[5]，火龙果采收上市极易造成旺产滞销。因此，寻求新的加工思路，是促进火龙果保值、增值的重要手段。开展火龙果水提物对皮肤的安全性及其体内抗氧化活性研究，对提高火龙果附加值，促进贵州火龙果产业可持续发展具有重要现实意义。【前人研究进展】贵州火龙果的加工产品仅为果汁、果酒和果脯等，加工方式较单一，产品影响力较小，市场占比较低。近年来，火龙果中活性物质的提取成为新的研究热点。目前对火龙果有效成分提取的研究已有文献报道。何丽芳等[6-7]采用超声波辅助乙醇法提取红心火龙果中的原花青素和花色苷。李国胜等[8]采用亚临界水法提取火龙果茎中的多糖，提取率为20.53%。王雨欣等[9]采用超声波-微波协同萃取提取火龙果果皮黄酮，提取率为6.93 mg/g。胡元庆等[10]采用微波辅助法提取火龙果果皮色素，提取率为1.07%。朱玲等[11]采用超声波辅助提取火龙果果皮中的果胶，提取率为12.65%。另外，火龙果的酚类物质在人体内可以清除自由基，总抗氧化能力为39.02 U/mL，能起到抗氧化的作用[12]；多糖类成分可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的活性[13]；甜菜素具有抗炎作用[14]；果汁提取物具有舒化血管的作用[15]；氨基酸具有提高免疫力和改善皮肤敏感性的作用[16]。【研究切入点】随着贵州火龙果产量与种植面积双增长，为促进农民增收及产业良性发展，亟需提高其商品附加值的加工新思路。目前已有对火龙果花色苷、黄酮和多糖等提取的相关研究，但鲜见对火龙果水提物的研究与应用，因此，以紫红龙火龙果为研究对象，研究其水提物对皮肤安全性及体内抗氧化性。【拟解决的关键问题】以SPF级大鼠为研究对象，通过皮肤涂抹的方法研究紫红龙火龙果水提物对大鼠皮肤的急性经皮毒性及其皮肤含水量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的影响，探明紫红龙火龙果水提物对皮肤的安全性及其体内抗氧化活性，为提高火龙果附加值，扩大其在食品、化妆品等领域开发应用提供毒理学依据，进而为促进贵州火龙果产业可持续发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 火龙果 采自贵州省果树科学研究所安顺市镇宁县热带亚热带果树科研示范基地，为成熟度适中且无机械损伤的紫红龙火龙果。

1.1.2 SPF级大鼠 38只，雌雄各半，230～280 g，大鼠及其饲料均购于重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司。

1.1.3 试剂 冰醋酸(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化岐化酶(SOD)试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。火龙果水提物，自制。

1.1.4 主要仪器设备 JEA501电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；H1850-R型冷冻离心机，湖南湘仪仪器有限公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；KW-100TDV超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电陶炉(2 200 W)及纯露精油提取器，成都普检仪器有限公司；Elx800酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；智显皮肤测试仪，宁波市瑞尔芭比医疗设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性经皮毒性试验 参照《化妆品安全技术规范》[17]中的急性经皮毒性试验方法，选择SPF级大鼠10只(雌雄各半，雌性未孕且未曾产仔)进行1次限量法试验，适应性饲养，试验前24 h将其背部去毛30 cm2(5 cm×6 cm)。将0.5 mL水提物均匀涂抹于大鼠背部剃毛区域，用无刺激胶布固定，避免大鼠舔食，每只大鼠分笼饲养。涂抹受试物24 h后，用清水除去残留受试物。观察大鼠死亡情况及中毒表现，包括大鼠的眼睛和黏膜、呼吸、中枢神经系统及四肢活动等，持续观察7 d。

1.2.2 皮肤刺激性试验 参照《化妆品安全技术规范》[17]中的单次皮肤刺激和多次皮肤刺激方法进行试验。1)单次。选择SPF级大鼠6只(雌雄各半)适应性饲养，试验前24 h将其背部去毛30 cm2(5 cm×6 cm)。将0.5 mL火龙果水提取物均匀涂抹大鼠背部剃毛区域，用无刺激胶布加以固定，封闭24 h后用清水去除残留受试物。于去除残留受试物后1 h、3 h、8 h、24 h、48 h和72 h观察涂抹部位皮肤反应，并对其皮肤有无红斑结痂和水肿的形成按照皮肤刺激反应评分标准(表1)进行评分，以受试物动物的积分平均值进行综合评价。根据积分均值判断皮肤刺激强度：0～0.5分，无刺激性；0.5～2.0分，轻刺激性；2.0～6.0分，中刺激性；6.0～8.0分，强刺激性。2)多次。选择SPF级大鼠10只(雌雄各半，雌性未孕且未曾产仔)适应性饲养，试验前24 h将试验动物的背部脊柱两侧各去毛4 cm2(2 cm×2 cm)，其中左侧皮肤为对照区(未涂抹火龙果水提物)，右侧皮肤为试验区。将0.5 mL火龙果水提物均匀涂抹在右侧皮肤，每天1次，每次给予前需提前剃毛，连续涂抹14 d，涂抹1 h后，观察皮肤状态，试验区和对照区按照表1进行评分。14 d后，计算每天每只动物平均积分，根据积分均值判断皮肤刺激强度。

表1 皮肤刺激反应评分标准

每天每只动物平均积分=(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14

1.2.3 大鼠背部皮肤的抗氧化能力测定 对皮肤抗氧化能力的影响参照《化妆品安全技术规范》[17]中的方法，主要通过检测皮肤含水量、大鼠皮肤组织丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性等指标进行评价。

1) 含水量。将12只涂抹火龙果水提物的SPF级大鼠(雌雄各半，体重200.0～250.0 g)饲养5 d后，选取大鼠背部左右对称皮肤进行剃毛(面积为2.5 cm×2.5 cm)，剃毛24 h后开始试验。大鼠背部右侧剃毛区给予火龙果水提物，给药量为600 mg/kg，给药面积为2 cm×2 cm，连续给药30 d，在左侧剃毛区域给予等体积生理盐水作对照。给药期间需在给药前12 h对大鼠背部皮肤进行剃毛清理。分别在给药 14 d、23 d和30 d采用智显皮肤测试仪进行皮肤含水量测定。

2) 丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。于皮肤含水量测定试验停止给药24 h后(第31天)对大鼠背部左右两侧皮肤进行取材，采用脊椎脱臼法将大鼠处死，取背部左右两侧皮肤(1 cm×1 cm)，放入-80℃冰箱保存。采用分析天平称取皮肤组织，按照重量(g)∶体积(mL)=1∶9 的比例加入生理盐水，将组织剪碎并用手握式匀浆器进行冰浴匀浆，匀浆后3 000 r/min离心10 min，取上清液于-80℃冰箱保存。采用试剂盒检测丙二醛含量，按说明书将测试样品与其余试剂依次加入，混匀后95℃水浴加热40 min，冷却后放入离心机，3 500 r/min离心10 min。取上清液放入细胞培养板中，盖上防尘盖，放入酶标仪中测量吸光度，测定波长为532 nm。采用试剂盒测定SOD活性，按照说明书将待测匀浆上清液与其余试剂依次加入，混匀后37℃恒温孵育20 min，使用酶标仪测定吸光度，测定波长为450 nm。计算丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。

MDA含量(nmol/mg prot)=[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]/[标准品浓度(10 nmol/mL)/待测样本蛋白浓度(mg prot/mL)]

SOD活性(U/mg prot)=[SOD抑制率×待测样本蛋白浓度(mg prot/mL)]/反应体系稀释倍数

1.3 数据统计与分析

数据采用SPSS 20.0进行邓肯氏差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 皮肤刺激性

2.1.1 急性经皮毒性 对试验大鼠给予火龙果水提物后，分别于1 h、3 h、8 h、24 h观察，大鼠一般生活状况无明显变化，呼吸、肢体、行为活动等正常，未出现震颤、抽搐、腹泻、昏迷等现象。连续观察7 d均未出现明显中毒症状及死亡现象。

2.1.2 单次皮肤刺激性 观察发现，单次给药后，个别大鼠因为舔舐抓挠形成皮肤局部红斑，但均未出现水肿。因此，评分时仅对红斑情况进行评分。从表2看出，平均总积分为0.17～0.50分，且随处理时间延长平均总积分呈增加趋势，但在观察时段内皮肤刺激强度均表现为无刺激性，且所有大鼠均未出现水肿现象。

表2 火龙果水提物给予大鼠单次皮肤刺激反应不同时段的评分

2.1.3 多次皮肤刺激性 观察发现，给予火龙果水提物连续14 d期间，大鼠无毒性症状和死亡现象出现。各组大鼠外观及行动正常，皮毛光泽，眼、耳、口、鼻未见异常分泌物。大鼠皮肤形成局部红斑，均未出现水肿，未见刺激性，与对照无明显差异。从表3看出，多次给予大鼠火龙果水提物后，给药处理和对照均在给予火龙果水提物第2天出现症状且刺激反应评分呈先升后降趋势。其中，给药处理于给予火龙果水提物第2天出现轻微红斑，第4～6天时红斑症状最严重，第7天时红斑开始消退，随着时间推移症状减轻，在给予火龙果水提物第10天时红斑消失；对照于第2天出现红斑，第4天时红斑最严重，第11天时红斑消失。给药处理和对照每天每只动物积分均值分别为0.179分和0.221分，积分均低于0.5分，表明，火龙果水提物外用对大鼠的完整皮肤无刺激作用。

表3 火龙果水提物多次皮肤刺激反应不同时段的评分

2.2 火龙果水提物处理大鼠皮肤的含水量

从表4看出，对照大鼠皮肤的含水量随时间推移呈先降后升趋势，但差异不显著；给药处理大鼠皮肤含水量呈逐渐上升趋势，23～30 d含水量较14～23 d增加迅速，第30天较第14天时显著增加73.6%；给药处理在第23天和第30天分别较对照显著提高56.8%和30.5%。观察发现，对照大鼠背部皮肤光滑柔软，但触感略为粗糙，而给药处理大鼠皮肤表面光滑柔软且触感较细致。

表4 火龙果水提物处理不同时段大鼠皮肤的含水量

2.3 火龙果水提物处理大鼠皮肤组织的MDA含量和SOD活性

从表5看出，给药处理大鼠皮肤组织中MDA含量为0.92 nmol/mg，较对照(3.04 nmol/mg)显著降低69.7%；给药处理大鼠皮肤组织中SOD活性为3.04 U/mg，较对照(2.77 U/mg)提升20.6%，但差异不显著。

表5 火龙果水提物处理大鼠皮肤的MDA含量和SOD活性

3 讨论

紫红龙火龙果是贵州省主要栽培的品种之一，其不仅营养丰富且具有一定药用价值[18]，其有效成分具有抑菌、抗炎、调节免疫、降血糖、降血脂及抗癌等功效[19-21]，且不具有毒性[22]。研究采用的水蒸气蒸馏法常用于植物果实、果皮及中药材有效成分的提取[23-25]，主要提取成分为挥发性物质、小分子生物碱及部分酚类物质等。火龙果水提物为液体且无色无味，经急性经皮毒性试验，所有大鼠均未出现中毒症状及死亡现象，对大鼠进行单次、多次皮肤刺激后，个别大鼠因为舔舐抓挠形成皮肤局部红斑，但均未出现水肿，给药组和对照组每天每只动物积分均值分别为0.179分和0.221分，积分均低于0.5分，表明火龙果水提物外用对大鼠的完整皮肤无刺激作用。

有研究发现，中华猕猴桃水提液对羟自由基的清除率可达95.57%[26]；通过饮用百香果果壳水提物，肉兔血清中SOD活性可达172.45 U/mL，有效降低氧化应激[27]；通过给小鼠灌服600 mg/mL的西番莲水提物，可以降低股四头肌中MDA的含量，具有防止肌肉疲劳的作用[28]。该研究大鼠皮肤涂抹火龙果水提物后其表面光滑柔软且触感较为细致，在第23天和第30天时皮肤含水量分别显著高于对照56.8%和30.5%，表明水提物对大鼠皮肤的水和作用有帮助。目前多数学者认为，机体发生膜质过氧化会导致新陈代谢失常及免疫力降低，而发生膜质过氧化主要是由于机体内活性氧大量生成，体内抗氧化系统与之失调[25]所致。自由基-氧化应激是导致皮肤衰老的重要原因，当活性氧含量超过机体自身抗氧化系统所能平衡的范围后就会导致抗氧化系统失调并破坏细胞膜的完整结构，引发细胞凋亡等结果[29]。MDA的含量可反应体内膜质过氧化的程度，SOD是对抗活性氧的酶之一，抑制MDA含量，增强SOD活性，从而清除多余的氧自由基，使机体内氧化与抗氧化处于动态平衡状态。研究结果表明，给药处理30 d后大鼠MDA含量较对照显著降低69.7%，SOD活性较对照提升20.6%，表明，涂抹火龙果水提物能提升大鼠皮肤的抗氧化能力。

4 结论

急性经皮毒性试验、单次皮肤刺激性试验和多次皮肤刺激性试验的个别大鼠皮肤形成局部红斑，但均未出现水肿，总体评分显示火龙果水提物对大鼠皮肤无刺激性；连续给药30 d，火龙果水提物可显著提高大鼠背部皮肤含水量，显著降低大鼠皮肤组织的MDA含量并可提高SOD活性；火龙果水提物对大鼠皮肤无刺激作用，且有一定的抗氧化作用。