慢性阻塞性肺疾病动物模型研究进展

曾德优，张六一，肖 创，王略力，黄 蓉，方 雁，，杜晓华，Yusef Absi(约旦)，陈 晨， 杨为民

(1.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650031)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见的、可以预防和治疗的呼吸系统疾病，以持续呼吸症状和气流受限为特征，通常是由于暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和肺泡病变所致[1]。临床上COPD分为稳定期和急性加重期(Acute exacerbation of COPD，AECOPD)，病毒和细菌感染是导致COPD急性加重的主要诱因。AECOPD患者全身炎症反应增强，目前应用最广泛的治疗药物是糖皮质激素[2]，其在降低COPD患者住院率、病死率和疾病严重程度方面发挥着关键作用[3]。

1 模型动物

COPD动物模型的肺部解剖结构应与人类相似，以便更好模拟人类COPD的病理生理特征。目前建立COPD模型的动物种类繁多，例如大鼠、小鼠、犬、羊、家兔、猴子、小型猪等。其中啮齿类小动物是最常用的COPD、AECOPD模型动物。大小鼠生命周期短，品系多，易饲养，生长发育快，性情较温驯，饲养繁殖成本较低；其生理特征、病理特征与人类有很多相似[4-5]。其优点有基因背景明确、可操作性好、饲养和维护费用低、节省人力和物力等[6]。且大多数选择SPF级Wistar大鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、昆明小鼠等作为复制COPD、AECOPD疾病模型的动物。

2 常用COPD大小鼠模型造模方法

2.1 单因素诱导模型

2.1.1 香烟烟雾模型：香烟烟雾(Cigarette smoke，CS)的刺激可诱导气道基因表达的改变，还会增强肺部的氧化应激反应，引起肺部的局部炎症和小气道重塑[7-8]。Xiao等[9]通过长期CS暴露28周的方法成功建立了COPD大鼠模型。Beckett等[10]采用CS口鼻暴露小鼠8周后出现气道重塑、肺气肿和肺功能下降。CS暴露诱导建立的COPD大小鼠模型符合COPD的许多疾病特征，但不同的动物对CS的敏感程度不一样[11]；此外，CS暴露的方法和时间也会导致COPD大小鼠模型的诱导结果不一致[8]。其中，采用单纯CS口鼻暴露小鼠八周以上的方法效果更佳，且暴露时间还可适当延长。

2.1.2 脂多糖模型：脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是效应较强的致热源革兰阴性菌内毒素的活性成分和特有结构[12]，可引起气道上皮损伤，诱发气道炎症。常以气管内滴注、滴鼻吸入的方式来诱导COPD模型，且通过反复滴注可模拟反复感染[13]。LPS导致的肺部病理生理学变化与COPD模型的表现很相似[14]。有研究表明[15]，单独采用LPS暴露的方法可成功诱导建立COPD动物模型。LPS诱导建立的COPD大小鼠模型的病理变化符合COPD的病理特征，且造模时间短，方法简便易行[16]，其中以气管内滴注的方式来复制COPD动物模型效果更好。

2.1.3 蛋白酶模型：蛋白酶(Protease)是生物体内的一类酵素(酶)，以猪胰弹性蛋白酶应用最广泛；蛋白酶诱导建立COPD动物模型的方法是通过模拟COPD发病时蛋白酶/抗蛋白酶失衡机制[17]；造模方法主要有气管内滴入、雾化吸入、气管切开注射等。以蛋白酶诱导建立的COPD动物模型表现与COPD临床患者症状相似[18]。Ueno等[19]将猪胰弹性蛋白酶滴入小鼠气管，随时间的增加，小鼠肺泡破坏程度和炎症反应加重。该法造模简单迅速，动物感染少，模型病变程度可控，但是蛋白酶作用的发挥受动物品种、病理、生理机制等因素的影响[20]。

2.1.4 呼吸道病毒感染模型：呼吸道炎症的诱因包括呼吸道病毒、细菌等。有研究表明[21]，COPD患者对甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)易感性会增加。IAV感染后的模型动物肺部及全身炎症的表达水平升高、支气管扩张剂的反应水平降低[22]。通过对大鼠进行气道铜绿假单胞菌反复感染的方法建立的COPD大鼠模型表现出明显的COPD样病理学变化[23]。呼吸道感染虽然符合COPD临床诱因，但是要求维持合适的感染量[24]。通过气管内滴注病毒造成呼吸道感染的方法对实验操作及环境要求较高，但是模型效果较好。

2.1.5 大气污染物模型：英国生物样本库的一项基于人群研究证实了大气污染与COPD患病率增加有关[25]。有研究表明[26]臭氧、二氧化氮、二氧化硫等大气污染物的浓度和COPD的发病率呈明显的正相关性。Gao等[27]通过臭氧暴露C57BL/6小鼠的方法成功建立了COPD模型。Wu等[28]研究发现高浓度PM2.5会降低肺功能通气指标，抑制人的肺功能。通过臭氧、PM2.5等大气污染物诱导复制COPD大小鼠模型的方法包括气管内滴注、吸入等。

2.1.6 基因调控模型：COPD是一种多基因遗传易感性疾病，有研究表明[29]，在造成COPD疾病发作的因素中，易感性遗传基因是一个重要的因素。Richmond等[30]对小鼠特定基因进行敲除，影响小鼠气道表面分泌型免疫球蛋白A的表达，成功诱导出了小鼠COPD疾病模型。Borel等[31]运用第三代基因编辑技术成功复制出了小鼠COPD疾病模型。基因调控的方法是近年来兴起的一种新方法，能为COPD发病机制、疾病模型建立及相关研究提供新的研究方向。

2.2 复合因素诱导模型

2.2.1 香烟烟雾暴露联合脂多糖模型：CS暴露联合LPS的方法是目前国内外最常用的COPD造模方法。有研究表明[32]，CS暴露联合LPS诱导的COPD动物模型与人类COPD的病理表现更相似，造模成功后的动物支气管管腔变形，肺泡壁变薄断裂，管壁周围炎性细胞浸润。Shin等[33]对小鼠进行CS暴露7 d，第4天气管内滴入LPS，结果表明小鼠肺部生理结构发生改变，且肺部出现炎症反应。Lee等[34]的研究通过烟熏和内毒素联合的方法建立COPD动物模型，结果显示该方法复制的模型动物炎症反应比单纯烟熏法或单纯内毒素法较明显。张卓红等[35]采用CS暴露与气管内注射LPS建立COPD大鼠模型，结果显示模型组造模过程中第0.3 s用力呼气容积、第0.3 s用力呼气容积与用力肺活量的比值均低于对照组。应用香烟烟雾暴露联合脂多糖法建立COPD大小鼠模型，可以大大缩短COPD的造模时间，提高动物模型的稳定性，但是该造模方法影响因素较多，LPS给入的时间及剂量各异。

2.2.2 香烟烟雾暴露联合蛋白酶模型:Saluja等[36]的研究采用人唾液弹性蛋白酶联合香烟烟雾提取物气管内滴注大鼠，结果提示大鼠肺部结节白细胞浸润、肺泡增大，表明COPD大鼠模型基本复制成功。CS暴露联合气管内注入蛋白酶的方法可以减少蛋白酶的用量，缩短造模的时间；但CS暴露联合蛋白酶模型也存在一些缺陷，如气管内滴注蛋白酶时需要对模型动物进行气管切开，加之烟雾暴露的过程，易造成模型动物创伤难以恢复甚至诱发感染。

2.2.3 香烟烟雾暴露联合细颗粒物(PM2.5)模型:大气污染物中的主要成分PM2.5能渗透到肺泡引起明显的炎症和氧化应激等反应[37]。Gu等[38]将小鼠暴露于CS和PM2.5，成功复制出了COPD小鼠模型。Chu等[39]应用CS联合PM2.5悬浮微粒吸入暴露的方法诱导小鼠模型，结果显示模型小鼠肺部出现明显的COPD病理学改变，提示COPD小鼠模型复制基本成功。虽然该方法目前使用不广泛，但就目前国内吸烟人数的激增和PM 2.5污染形势愈发地严峻，以此法建立COPD动物模型的研究具有一定的价值。

2.2.4 香烟烟雾暴露联合流感病毒模型:目前COPD的发生危险因素众多，且机制尚未明确,呼吸道病毒的感染也是COPD恶化及COPD急性加重期发生的重要因素。AECOPD患者全身炎症反应加强，临床上常用的治疗药物一般为糖皮质激素和抗生素[2,40]。但是，糖皮质激素长期吸入和多种抗菌药物联合使用与COPD患者合并感染性肺炎的发生有密切关系[41]。有研究者使用常见的流感病毒在C57小鼠CS暴露20周后进行感染，发现小鼠气道中TNF-α、IL-6等表达增加,炎症急剧加重[42]。Xiao等[43]通过CS暴露18周联合H1N1病毒感染C57BL/6 J雄性小鼠的方法成功建立了AECOPD小鼠模型。诸多研究表明,CS暴露联合病毒感染对大小鼠COPD的发生发展有协同促进作用。

2.2.5 香烟烟雾暴露联合细菌感染模型:COPD急性加重期的发病因素主要是细菌或病毒感染。有研究者[44]在香烟烟雾暴露SD大鼠90 d后，使用医院获得性肺炎常见的致病菌铜绿假单胞菌和社区获得性肺炎的主要病原菌肺炎链球菌进行气管内滴注，结果显示铜绿假单胞菌组、肺炎链球菌组大鼠肺组织病理改变明显加重，肺组织匀浆培养为阳性，提示AECOPD大鼠模型成功建立。Huang等[45]在C57BL/6J小鼠连续香烟烟雾暴露8周的过程中，每5 d 1次经鼻吸入0.1 ml的肺炎克雷伯菌液(6×108CFU/ml)成功建立小鼠AECOPD模型。采用香烟烟雾联合气管内滴注细菌的方法操作简便、动物创伤较小，能较好的模拟AECOPD模型；而感染细菌采用滴鼻吸入的方法，动物吸入细菌混悬液的体积难以精准定量。

3 结 语

慢性阻塞性肺疾病是以慢性呼吸系统症状、肺功能损害、肺气肿等为特征的一种临床综合征[46]，其主要的危险因素是吸烟,而细菌或病毒是AECOPD的主要诱因。AECOPD患者预后判断指标尤为重要，有研究发现IFN-γ与AECOPD患者的肺功能和预后情况明显相关,可作为判断的可靠指标。人类COPD病因及机制等比较复杂，尽管近年来对COPD、AECOPD动物模型的研究不断深入，但是大多数动物模型仅能模拟轻度病理、生理改变，难以精准复制。目前造模方法种类繁多，缺乏统一的标准，且单一因素诱导建模耗时长、成模效果较差，而采用多种因素联合诱导建立COPD、AECOPD动物模型的方法也越来越多，但是模型效果差异较大。香烟烟雾暴露联合脂多糖气管内滴注诱导建立COPD大小鼠模型的方法可操作性较好、耗时较短、效果较为显著。通过对多种COPD大小鼠动物模型的造模方法概述，同时评价这些造模方法的一些优缺点，可为COPD病理机制研究、新药的研发及COPD动物模型的建立提供了一定的参考价值和基础。