红树老鼠簕来源内生青霉Penicillium sp.GXIMD 03101的次级代谢产物研究*

2022-12-07 09:17谭玉莹曹广萍黄炯丽李秋庭唐振洲刘永宏高程海
广西科学 2022年5期
关键词:红树柱层析硅胶

谭玉莹,曹广萍,黄炯丽,李秋庭,唐振洲,刘永宏,高程海,白 猛 **

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004;2.广西中医药大学海洋药物研究院,广西南宁 530200)

红树植物生长于热带和亚热带地区海岸潮间带,给红树微生物提供了特殊的宿主环境[1],致使红树微生物次级代谢产物的结构类型和生物活性具有多样性。近年来,从红树来源内生青霉中发现了许多结构新颖的活性次级代谢产物,如具有抗肿瘤活性的二氧哌嗪类生物碱 penicisulfuranols A-C[2],具有抗虫活性的混源萜类化合物penicianstinoids C-E[3],具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的倍半萜类化合物penicieudesmol F[4]、喹诺酮类生物碱 (±)-oxypenicinolines A[5]和异香豆素类化合物(R)-2-chloro-3-(8-hydroxy-6-methoxy-1-oxo-1H-isochromen-3-yl)propyl acetate[6],以及具有抗炎活性的三烯类化合物pinophols C-D[7]等。以上研究表明从红树内生青霉中挖掘活性次级代谢产物作为药物的先导化合物具有很大潜力,是海洋天然活性产物的重要研究方向之一。本文对一株红树老鼠簕AcanthusilicifoliusL.来源的内生青霉Penicilliumsp.GXIMD 03101的次级代谢产物进行研究,采用多种现代分离方法获取其中的化合物,并对化合物进行抗胰腺癌活性筛选,为进一步研究开发红树内生青霉来源的天然抗胰腺癌药物提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂

SHIMADZU LC-2030C高效液相色谱仪 (日本岛津公司),Bruker AV-400 MHz超导核磁共振仪 (瑞士Bruker公司),JNM-ECZ600R超导核磁共振仪 (日本电子株式会社),EYELA N-1300D旋转蒸发仪 (日本东京理化有限公司),普利塞斯EP225SM-DR电子天平 (瑞士普利塞斯公司),WFH-2038暗箱式紫外分析仪 (杭州齐威仪器有限公司),300-400目正相硅胶、HSGF254薄层层析硅胶板 (烟台江友硅胶开发有限公司),十八烷基硅烷键合硅胶 (上海麦克林生化科技股份有限公司),Sephadex LH-20 (上海麦克林生化科技股份有限公司),石油醚、乙酸乙酯、甲醇 (分析纯,上海泰坦科技股份有限公司),甲醇 (色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司)。

1.1.2 菌株来源

内生青霉Penicilliumsp.GXIMD 03101分离自红树植物老鼠簕AcanthusilicifoliusL.的根部,老鼠簕根样品于2020年7月采自广西山口红树林生态自然保护区。菌种存放于广西中医药大学海洋药物研究院,为青霉属Penicilliumsp.菌株,GenBank号为MZ971181。

1.2 方法

1.2.1 菌种的发酵培养

在超净台内用灭菌后的接种环从接有Penicilliumsp.GXIMD 03101单一菌落的马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基中挑取菌株,转接至3瓶已灭菌的马铃薯葡萄糖水 (PDB) 液体培养基中。将PDB液体培养基置于37℃、180 r/min的摇床中振荡培养3 d获得种子液。将4 mL种子液转接至装有已灭菌80 g大米培养基的1 L三角瓶中,共150瓶,室温条件下培养30 d。

1.2.2 化合物提取与分离

用40 L的乙酸乙酯萃取发酵后的12 kg大米培养基,重复萃取3次,每次间隔5 d,合并浓缩萃取液,得到浸膏150 g。采用硅胶柱层析、凝胶柱层析及半制备高效液相色谱对浸膏进行分离纯化,并利用核磁共振方法鉴定化合物的结构。

1.2.3 抗胰腺癌细胞活性测定方法

由于其他化合物的质量相对比较少,且纯度不足,因此参考文献[8]的方法对部分化合物进行抗胰腺癌细胞活性测定。选用胰腺癌细胞 (SW1990)为试验对象,阳性对照为氟尿嘧啶。将对数生长期的肿瘤细胞加到96孔细胞培养板 (每孔200 μL),置于37℃培养箱中,在5% CO2的条件下培养24 h。每孔分别加入10 μL稀释的、不同浓度 (5个梯度)的单体化合物,并以正常细胞为空白对照,培养48 h。每孔再加入10 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 溶液,继续培养4 h。离心,去掉上清液,每孔加入100 μL二甲基亚砜 (DMSO),振荡15 min,使晶体完全溶解。用酶标仪测定每孔在570 nm处的吸光度(OD值),计算抑制率 (IR),IR(%)=[(OD对照-OD样品)/OD对照]×100%。

2 结果与分析

2.1 化合物的提取与分离结果

40 L的乙酸乙酯萃取大米发酵产物后所得的浸膏经过减压正相硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=100∶0∶0-0∶100∶0-0∶0∶100)得到10个组分 (Fr.1-Fr.10)。

Fr.5 (8 g) 经过常压正相硅胶柱层析 (石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=100∶0∶0-0∶100∶0-0∶0∶100) 得到9个组分 (Fr.5-1-Fr.5-9),其中Fr.5-3为化合物11(40.6 mg)。Fr.5-2 (50 mg) 经过Sephadex LH-20凝胶柱层析 (纯甲醇)、半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=90∶10) 纯化得到化合物5(2.0 mg,9.7 min)。Fr.5-4 (100 mg) 经过中压反相硅胶柱层析 (甲醇∶水=10∶90-100∶0)、半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=90∶10) 纯化得到化合物4(7.7 mg,14.0 min)。Fr.5-6经过半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=95∶5) 纯化得到化合物10(4.6 mg,5.6 min)、化合物12(5.1 mg,12.8 min) 和化合物13(4.8 mg,15.7 min)。Fr.5-8 (4 g) 经过中压正相硅胶柱层析 (石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=50∶50∶0-0∶100∶0-0∶0∶100)、中压反相硅胶柱层析 (甲醇∶水=10∶90-100∶0)、半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=70∶30) 纯化得到化合物6(3.6 mg,10.1 min)。

Fr.8 (6 g) 经过常压正相硅胶柱层析 (石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=50∶50∶0-0∶100∶0-0∶0∶100) 得到7个组分 (Fr.8-1-Fr.8-7)。Fr.8-3 (2 g) 经过中压反相硅胶柱层析 (甲醇∶水=10∶90-100∶0) 得到9个组分 (Fr.8-3-1-Fr.8-3-9)。Fr.8-3-5经过半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=65∶35) 纯化得到化合物2(31.2 mg,21.7 min)。Fr.8-3-7经过半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=83∶17) 纯化得到化合物1(37.8 mg,23.6 min)。Fr.8-4 (1.5 g) 经过中压反相硅胶柱层析 (甲醇∶水=10∶90-100∶0)、半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=15∶85) 纯化得到化合物9(13.5 mg,14.0 min)。Fr.8-6 (1 g) 经过中压反相硅胶柱层析 (甲醇∶水=10∶90-100∶0)、半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=5∶95) 纯化得到化合物7(9.2 mg,9.0 min) 和化合物8(8.8 mg,17.0 min)。

Fr.10 (2 g) 经过中压正相硅胶柱层析 (二氯甲烷∶甲醇=100∶0-0∶100) 得到8个组分 (Fr.10-1-Fr.10-8)。Fr.10-2经过半制备高效液相色谱 (甲醇∶水=90∶10) 纯化得到化合物3(3.6 mg,17.7 min)。

2.2 化合物的结构

从红树老鼠簕内生青霉Penicilliumsp.GXIMD 03101中分离出13个化合物,它们的结构如图1所示。

图1 化合物1-13的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-13

2.3 化合物的波谱数据

化合物1:黄色粉末,熔点为293℃,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:11.45 (s,5-OH),7.46 (s,H-8),7.19 (s,H-6),5.45 (d,J=4.0 Hz,2-OH),4.39 (s,H-2),3.37 (s,H-1),2.78 (d,J=4.0 Hz,H-3),2.42 (s,H-11);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:194.0 (C,C-9),185.9 (C,C-10),180.6 (C,C-4),160.1 (C,C-5),147.5 (C,C-7),132.0 (C,C-8a),124.0 (CH,C-6),120.4 (CH,C-8),114.2 (C,C-10a),106.1 (C,C-4a),68.5 (CH,C-2),58.3 (CH,C-3),55.6 (C,C-9a),47.7 (CH,C-1),21.4 (CH3,C-11)。将以上数据与文献[9]数据进行对比,确定化合物1为 (+)-rugulosin A。

化合物2:黄色粉末,熔点为292℃,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:14.78 (br s,4-OH),11.52 (d,J=12.0 Hz,5,5′-OH),7.59 (s,H-8),7.46 (s,H-8′),7.29 (s,H-6),7.19 (s,H-6,6′),5.50 (d,J=36.0 Hz,2,2′-OH),4.62 (s,H-11),4.40 (s,H-2,2′),3.38 (s,H-1,1′),2.78 (t,J=4.0 Hz,H-3,3′),2.43 (s,H-11′);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:194.1 (C,C-9),194.0 (C,C-9′),186.7 (C,C-4),185.9 (C,C-4′),180.6 (C,C-10),179.9 (C,C-10′),160.2 (C,C-5,5′),152.0 (C,C-7),147.5 (C,C-7′),132.0 (C,C-8a,8′a),124.0 (CH,C-6′),120.7 (CH,C-6),120.4 (CH,C-8′),117.0 (CH,C-8),114.9 (C,C-10a),114.2 (C,C-10′a),106.1 (C,C-4a),106.1 (C,C-4′a),68.5 (CH,C-2,2′),62.0 (CH2,C-11),58.5 (CH,C-3),58.4 (CH,C-3′),55.6 (C,C-9a),55.6 (C,C-9′a),47.8 (CH,C-1,1′),21.4 (CH3,C-11′)。将以上数据与文献[10]数据进行对比,确定化合物2为 (+)-rugulosin B。

化合物3:橙红色粉末,熔点为270℃,1H NMR (600 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:12.78 (s,1-OH),12.04 (s,5-OH),7.27 (s,H-8),7.14 (s,H-6),6.69 (s,H-4),2.32 (s,H-11);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:189.4 (C,C-10),182.0 (C,C-9),164.6 (C,C-3),164.3 (C,C-1),161.0 (C,C-5),148.1 (C,C-7),133.2 (C,C-8a),131.2 (C,C-4a),123.7 (C,C-2),123.5 (CH,C-6),120.4 (CH,C-8),113.1 (C,C-10a),108.7 (C,C-9a),107.1 (CH,C-4),21.4 (CH3,C-11)。将以上数据与文献[11]数据进行对比,确定化合物3为 1,1′,3,3′,5,5′-hexahydroxy-7,7′-dimethyl[2,2′-bianthracene]-9,9′,10,10′-tetraone。

化合物4:橙红色粉末,熔点为203℃,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:7.40 (d,J=1.2 Hz,H-4),7.16 (d,J=2.0 Hz,H-5),7.10 (s,H-2),6.79 (d,J=2.0 Hz,H-7),3.88 (s,H-12),2.37 (s,H-11);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:186.0 (C,C-9),182.4 (C,C-10),165.3 (C,C-8),163.5 (C,C-1),161.7 (C,C-6),146.4 (C,C-3),136.7 (C,C-4a),132.0 (C,C-10a),124.1 (CH,C-2),119.0 (CH,C-4),114.4 (C,C-9a),112.1 (C,C-8a),107.4 (CH,C-5),105.0 (CH,C-7),56.2 (CH3,C-12),21.3 (CH3,C-11)。将以上数据与文献[12]数据进行对比,确定化合物4为 questin。

化合物5:橙红色粉末,熔点为255℃,1H NMR (600 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:7.52 (s,H-4),7.19 (s,H-2),7.12 (s,H-5),6.58 (s,H-7),2.42 (s,H-11);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:189.6 (C,C-9),181.5 (C,C-10),164.5 (C,C-8),166.0 (C,C-6),161.4 (C,C-1),148.1 (C,C-3),135.1 (C,C-10a),132.9 (C,C-4a),124.1 (CH,C-2),120.4 (CH,C-4),113.6 (C,C-9a),108.9 (C,C-8a),108.6 (CH,C-5),107.9 (CH,C-7),21.5 (CH3,C-11)。将以上数据与文献[13]数据进行对比,确定化合物5为 emodin。

化合物6:黄色粉末,熔点为200℃,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:7.55 (d,J=0.8 Hz,H-4),7.17 (d,J=0.8 Hz,H-2),6.65 (d,J=1.6 Hz,H-5),4.56 (s,H-11),3.86 (s,H-12);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:185.3 (C,C-9),182.5 (C,C-10),164.5 (C,C-6),163.9 (C,C-8),161.8 (C,C-1),150.6 (C,C-3),136.7(C,C-4a),132.2(C,C-10a),120.8 (CH,C-2),115.5 (CH,C-4),115.4 (C,C-9a),112.7 (C,C-8a),108.5 (CH,C-5),105.2 (CH,C-7),62.1 (CH3,C-11),56.0 (CH3,C-12)。将以上数据与文献[12]数据进行对比,确定化合物6为 questinol。

化合物7:无色粉末,熔点为165℃,1H NMR (400 MHz,CD3OD,Jin Hz)δH:8.01 (d,J=8.0 Hz,H-6),5.90 (d,J=4.0 Hz,H-1′),5.70 (d,J=8.0 Hz,H-5),4.16 (m,H-2′,3′),4.00 (m,H-4′),3.83 (d,J=2.8,12.4 Hz,H-5′b),3.73 (d,J=3.2,12.4 Hz,H-5′a);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δC:166.1 (C,C-4),152.4 (C,C-2),142.7 (CH,C-6),102.6 (CH,C-5),90.7 (CH,C-1′),86.3 (CH,C-4′),75.7 (CH,C-3′),71.3 (CH,C-2′),62.2 (CH2,C-5′)。将以上数据与文献[14]数据进行对比,确定化合物7为 uridine。

化合物8:无色晶体,熔点为192℃,1H NMR (400 MHz,CD3OD,Jin Hz)δH:7.81 (d,J=1.2 Hz,H-6),6.27 (t,J=6.8 Hz,H-1′),4.39 (m,H-3′),3.90 (dd,J=3.2,6.8 Hz,H-4′),3.75 (m,H-5′),2.22 (m,H-2′),1.87(d,J=1.2 Hz,H-7);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δC:166.4 (C,C-4),152.2 (C,C-2),138.1 (CH,C-6),111.5 (C,C-5),86.2 (CH,C-1′),88.8 (CH,C-4′),72.2 (CH,C-3′),41.1 (CH2,C-2′),62.2 (CH2,C-5′),12.4 (CH3,C-7)。将以上数据与文献[15]数据进行对比,确定化合物8为 2′-deoxythymidine。

化合物9:无色粉末,熔点为202℃,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:7.62 (d,J=8.0 Hz,H-6),5.74 (d,J=4.8 Hz,H-1′),5.67 (d,J=8.0 Hz,H-5),4.23 (dd,J=3.2,12 Hz,H-5′b),4.15 (dd,J=5.6,12 Hz,H-5′a),4.07 (t,J=4.8 Hz,H-4′),3.98 (m,H-2′),3.93 (t,J=5.2 Hz,H-3′);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:170.3 (C,C-1″),163.1 (C,C-4),150.6 (C,C-2),140.8 (CH,C-6),102.1 (CH,C-5),88.7 (CH,C-1′),81.1 (CH,C-4′),72.7 (CH,C-2′),69.8 (CH,C-3′),63.8 (CH2,C-5′),20.1 (CH3,C-2″)。将以上数据与文献[16]数据进行对比,确定化合物9为 5′-O-acetyl uridine。

化合物10:白色粉末,熔点为156℃,1H NMR (600 MHz,CDCl3,Jin Hz)δH:5.51 (m,H-6),5.33 (m,H-7),5.26 (m,H-23),5.18 (m,H-22),3.57 (m,H-3),2.40 (m,H-4a),2.21 (m,H-4b),1.18 (s,H-21),0.94 (s,H-19),0.92 (s,H-28),0.84 (s,H-27),0.83 (s,H-26),0.62 (s,H-18);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δC:141.4 (C,C-8),139.7 (C,C-5),135.6 (CH,C-22),132.0 (CH,C-23),119.7 (CH,C-6),116.4 (CH,C-7),70.5 (CH,C-3),55.8 (CH,C-17),54.6 (CH,C-14),46.3 (CH,C-9),42.8 (CH,C-24),42.8 (C,C-13),40.7 (CH2,C-4),40.5 (CH,C-20),39.1 (CH2,C-12),38.4 (CH2,C-1),37.1 (C,C-10),33.1 (CH,C-25),31.9 (CH2,C-2),28.3 (CH2,C-16),23.1 (CH2,C-15),21.2 (CH2,C-11),21.2 (CH3,C-21),20.0 (CH3,C-27),19.7 (CH3,C-26),17.7 (CH3,C-28),16.3 (CH3,C-19),12.1 (CH3,C-18)。将以上数据与文献[17]数据进行对比,确定化合物10为 ergosta-5,7,22-triene-3β-ol。

化合物11:黄色油状,1H NMR (600 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:11.12 (s,8-OH),10.63 (br s,6-OH),6.23 (d,J=1.2 Hz,H-5),6.18 (d,J=2.4 Hz,H-7),4.68 (m,H-3),2.91 (dd,J=3,0,16.8 Hz,H-4a),2.80 (dd,J=11.4,16.8 Hz,H-4b),1.38 (d,J=6.6 Hz,H-11);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:169.4 (C,C-1),164.4 (C,C-6),163.4 (C,C-8),142.2 (C,C-10),107.8 (CH,C-5),100.1 (CH,C-7),100.8 (C,C-9),75.3 (CH,C-3),33.7 (CH2,C-4),20.3 (CH3,C-11)。将以上数据与文献[18]数据进行对比,确定化合物11为 (3R)-6-hydroxymellein。

化合物12:黄色油状,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:6.44 (d,J=1.6 Hz,H-7),6.38 (d,J=2.0 Hz,H-5),3.79 (s,H-11),2.18 (s,H-9),1.98 (s,H-10);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC:164.4 (C,C-6),163.4 (C,C-8),157.5 (C,C-1),150.2 (C,C-3),142.5 (C,C-4a),106.2 (C,C-4),100.8 (C,C-8a),100.3 (CH,C-5),98.6 (CH,C-7),55.7 (CH3,C-11),17.0 (CH3,C-9),12.4 (CH3,C-10)。将以上数据与文献[19]数据进行对比,确定化合物12为 6-hydroxy-8-methoxy-3,4-dimethylisocoumarin。

化合物13:白色粉末,熔点为167℃,1H NMR (600 MHz,DMSO-d6,Jin Hz)δH:10.89 (s,H-1),7.49 (d,J=7.8 Hz,H-4),7.34 (d,J=8.4 Hz,H-7),7.22 (d,J=1.8 Hz,H-2),7.08 (t,J=7.8 Hz,H-6),6.97 (t,J=7.2 Hz,H-5),3.62 (s,H-10);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC:174.5 (C,C-11),137.4 (C,C-8),128.5 (C,C-9),125.2 (CH,C-2),122.2 (CH,C-6),119.8 (CH,C-5),119.6 (CH,C-4),112.6 (CH,C-7),109.0 (C,C-3),32.4 (CH2,C-10)。将以上数据与文献[20]数据进行对比,确定化合物13为 indole-3-acetic acid。

2.4 抗胰腺癌细胞活性

对化合物1-4进行抗胰腺癌细胞活性测定。如表1所示,化合物1对胰腺癌细胞显示出较好的细胞毒活性,浓度为10 μmol/L时,对胰腺癌细胞的抑制率为75.6%。不同浓度下化合物2-4对胰腺癌细胞的抑制率为1.3%-56.0%。阳性对照氟尿嘧啶浓度为5 μmol/L时,对胰腺癌细胞的抑制率为78.4%。

表1 部分化合物对胰腺癌细胞的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of some compounds on pancreatic cancer cells

3 结论

本文对一株红树老鼠簕来源的内生真菌Penicilliumsp.GXIMD 03101的次级代谢产物进行研究,采用多种现代分离方法获得了13个化合物,经鉴定分别为6个蒽醌类化合物 (1-6),3个核苷类化合物 (7-9),1个甾醇类化合物 (10),2个异香豆素类化合物 (11,12),以及1个生物碱类化合物 (13)。其中,化合物1对胰腺癌细胞显示出较好的细胞毒活性,浓度为10 μmol/L时对胰腺癌细胞的抑制率为75.6%。

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