新疆4种阿魏乙醇提取物抗宫颈癌细胞活性的研究

马若婷，孙佳楠，赵生俊，张海英,3

(1新疆医科大学第四临床医学院，2新疆医科大学附属中医医院药学部，3新疆中药炮制研究重点实验室，乌鲁木齐 830000)

阿魏(Ferula.)为伞形科属种植物的树脂，具有消食、化癥、散痞、杀虫的功效，临床多用于肉食积滞、瘀血癥瘕、腹中痞块、虫积腹痛的治疗[1]。《新疆植物志》收载有17种香阿魏，其中荒地阿魏(Ferulasyreitschikowii)、多伞阿魏(Ferulafeurlaeoides)、山地阿魏(Ferulaakitschkensis)、准噶尔阿魏(Ferulasoongarica)等4种香阿魏分布较广，蕴藏量丰富，具有一定的应用开发价值。宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤。传统的宫颈癌治疗手段主要依靠手术、化疗和放疗，在杀灭肿瘤细胞的同时会对正常人体产生极大的毒副作用[2-3]，近些年来中药抗肿瘤作用或联合中药治疗肿瘤成为抗癌研究的热点。在国外有多篇文献报道阿魏属植物用于宫颈癌的治疗，Jian[4]等从阿魏(Feruladissecta)的根中分离出的两个新倍半萜苯甲酸衍生物syreiteate A和syreiteate B，对宫颈癌Hela细胞有较强的生长抑制作用。Zhang[5]等研究发现从阿魏根中分离得到的倍半萜类化合物TAW，对人宫颈癌Hela细胞有生长抑制作用，作用机制包含诱导细胞胞吞和自噬。本课题组研究发现[6-8]，阿魏对宫颈癌细胞及动物模型均有抗肿瘤作用，且抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭。本研究采用体外细胞与体内动物实验相结合，探究新疆4种阿魏乙醇提取物对宫颈癌细胞活性的抑制作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料荒地阿魏(Ferulasyreitschikowii)、多伞阿魏(Ferulaferulaeoides)、山地阿魏(Ferulaakitschkensis)、准噶尔阿魏(Ferulasoongarica)于2021年5月分别采集于乌鲁木齐市米东区、石河子市、托里县、塔城北山。均由新疆医科大学附属中医医院李永和主任中药师鉴定，为伞形科阿魏属植物的根，结果与《中国植物志》相符。

1.2 实验仪器ZHJH-C1112B超净工作台(中国上海智诚)；二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)；IX71-12FL/PH倒置荧光显微镜(Olympus公司)；TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂生产)；S-79943MULTISKAN酶标仪(Thermo公司)；贝克曼AU5800全自动生化分析仪(贝克曼库尔特商贸有限公司)；流式细胞检测仪(美国BD公司)。

1.3 试药MTT(美国Sigma公司，批号EZ6789D144)；胎牛血清(FBS)(美国Sigma公司，批号:BCBZ5164)；凋亡试剂盒(美国BD公司，批号：1182811)；顺铂注射液(江苏豪森药业集团有限公司，批号601210205)；丙氨酸氨基转氨酶(ALT)测定试剂盒(贝克曼库尔特试验系统(苏州)有限公司，批号AUZ9460)；天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)试剂盒(贝克曼库尔特试验系统(苏州)有限公司，批号AUZ9244)；胱抑素C(CysC)测定试剂盒(迈克生物股份有限公司，批号0821031)。

1.4 实验动物与细胞健康KM雌性小鼠，体重18～22 g，购自新疆医科大学动物实验中心(许可证号：SCXK(新)2018-0003)。饲养于新疆医科大学第四临床医学院药理实验室，明暗交替，动物自由饮水进食。小鼠宫颈癌U14细胞、人宫颈癌Hela细胞均购自中国医学科学研究院基础医学研究所。

1.5 新疆4种阿魏乙醇提取物的制备将新疆4种阿魏的根切片，用5倍量的95%酒精将阿魏根回流提取2 h，过滤，重复3次，将3次过滤液合并，减压浓缩，得到4种阿魏乙醇提取物的黑色稠浸膏，荒地阿魏、多伞阿魏、山地阿魏、准噶尔阿魏的浸膏得率分别为15.1%、28.4%、30.2%、26.7%。

1.6 指标的测定

1.6.1 新疆4种阿魏乙醇提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用 将细胞分为空白组、模型组以及新疆4种阿魏给药组。将处于指数生长期的宫颈癌Hela细胞消化计数，调整细胞混悬液的浓度到2×105个/mL，于96孔板中培养24 h，取1 g新疆4种阿魏乙醇提取物浸膏，DMSO稀释至10 mL至完全溶解，再吸取相应剂量的药物与细胞培养液配制为300、150、75、37.5、18.75和9.375 μg/mL 6个浓度，每孔内添加100 μL，每组设置6个复孔，空白组不添加液体，模型组是相同体积的10%FBS完全培养液，培养于CO2培养箱中。24 h后弃去96孔板上清液，将 MTT试剂100 μL加至96孔板，孵育4 h，每孔加入150 μLDMSO，用酶标仪(490 nm)检测吸光度，计算细胞增殖抑制率。采用Graphpa Prism 5软件计算各组IC50。以上实验重复3次。抑制率(%)=(模型组OD值-给药组OD值)/(模型组OD值-空白组OD值)×100%。

1.6.2 新疆4种阿魏乙醇提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖的凋亡作用 将处于指数生长期的宫颈癌Hela细胞消化计数，调整细胞混悬液的浓度到2×105个/mL，于6孔板中培养24 h，给药新疆4种阿魏乙醇提取物75 μg/mL，每孔内添加2 mL，药物作用24 h后，消化收集细胞并调整为1×106个/mL，添加400 μL的缓冲液，加入5 μL的Annexin V-FITC，避光反应15 min后加入5 μL的PI染液，上流式细胞检测仪检测，计算细胞总凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。重复实验3次。

1.6.3 新疆4种阿魏乙醇提取物对实验性宫颈癌U14小鼠的抑瘤作用 取体重18～22 g的KM雌性小鼠110只，适应性喂养3 d，将小鼠分为空白对照组、模型对照组、顺铂组和4种阿魏高、低剂量组。除空白对照组外，其他小鼠右前肢腋下接种2×106个/mL的鼠宫颈癌U14细胞混悬液，每只小鼠0.2 mL，次日进行灌胃给药。称取相应剂量4种阿魏乙醇提取物稠浸膏于乳钵中，食用油∶水∶吐温-80=8∶4∶1，加入容器中，研匀配制成含药乳剂，4种阿魏高、低剂量组分别给药1.5 g生药/kg、0.75 g生药/kg，空白对照组、模型对照组小鼠灌胃给药相同比例的空白乳剂，所有小鼠连续给药12 d；顺铂组5 mg/kg剂量每3 d进行腹腔注射，共注射4次。各组末次灌胃1 h后，小鼠摘眼球取血，静置离心后吸取血清，使用全自动生化分析仪器分析，得出ALT、AST以及CysC数据并记录。取血后立即脱颈处死，取出小鼠的肿瘤组织、脾、肾、胸腺，称量，计算其抑瘤率、脾指数、肾指数、胸腺指数。将肿瘤组织放置于10%的中性福尔马林溶液中浸泡保存。抑瘤率%=(模型对照组瘤重-给药组瘤重)/模型对照组瘤重×100%，脾指数=脾脏质量(mg)/体重(g)，肾指数=肾脏质量(mg)/体重(g)，胸腺指数=胸腺质量(mg)/体重(g)。

1.6.4 肿瘤组织苏木精-伊红(HE)染色 石蜡包埋法包埋各组小鼠肿瘤组织，病理切片机切片。梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，中性树胶封固。切片，用苏木精-伊红染色，于光学显镜下拍照(×200)，用于组织形态学观察。

2 结果

2.1 新疆4种阿魏乙醇提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用荒地阿魏、多伞阿魏、山地阿魏和准噶尔阿魏对人宫颈癌Hela细胞增殖有抑制作用，IC50分别为 25.67、32.67、50.03、54.07 μg/mL，见表1。

表1 新疆4种阿魏对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制结果/(μg/mL)

2.2 新疆4种阿魏乙醇提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖的凋亡作用新疆4种阿魏对人宫颈癌Hela细胞均有一定的促凋亡作用，给药浓度为75 μg/mL，细胞总凋亡率分别为准噶尔阿魏(68.23±5.21)%、荒地阿魏(53.67±3.46)%、山地阿魏(50.92±4.12)%、多伞阿魏(47.41±3.08)%。结果表明准噶尔阿魏的促人宫颈癌Hela细胞凋亡作用最强,见表2。

表2 新疆4种阿魏乙醇提取物对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

2.3 新疆4种阿魏的抑瘤作用模型对照组小鼠肿瘤组织明显较大，顺铂组、阿魏各给药组小鼠的肿瘤组织明显减小，荒地阿魏、多伞阿魏、山地阿魏、准噶尔阿魏高、低剂量组肿瘤重量明显低于模型对照组(P<0.05)。与顺铂组比较，新疆4种阿魏瘤重无显著性差异(P>0.05)。与空白对照组比较，模型对照组、4种阿魏给药组的脾脏重量明显升高(P<0.05)；4种阿魏给药组、顺铂组的肾脏指标未见显著改变，肾脏外观、颜色及形态均未见改变；模型对照组的胸腺重量显著升高，胸腺明显增生变大，颜色为白色无变化；荒地阿魏、多伞阿魏的胸腺指标与空白对照组比较无显著变化，山地阿魏、准噶尔阿魏、顺铂组的胸腺指标与空白对照组比较明显减小(P<0.05)。与模型对照组比较，4种阿魏的脾脏重量无明显变化，顺铂组脾脏重量明显减轻(P<0.05)；山地阿魏、准噶尔阿魏、顺铂组的胸腺指标明显减小(P<0.05)，见表3、4。与空白对照组比较，模型对照组及新疆4种阿魏给药组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转氨酶均无明显变化，表明药物对肝脏功能无明显的作用。与空白对照组比较，模型对照组及新疆4种阿魏给药组的胱抑素C均无明显变化，表明药物对肾脏功能无明显的作用；顺铂组的胱抑素C明显升高(P<0.05)，提示有一定程度的肾脏损伤，与顺铂临床应用的肾毒性相吻合,见表5。

表3 新疆4种阿魏对实验性宫颈癌U14小鼠的肿瘤、脏器重量的影响

表4 新疆4种阿魏对实验性宫颈癌U14小鼠脏器指数及抑瘤率的影响

表5 新疆4种阿魏对实验性宫颈癌U14小鼠肝肾功能的影响

2.4 肿瘤组织苏木精-伊红(HE)染色模型对照组肿瘤组织体积较大，呈圆形或者椭圆形，胞浆、核膜以及核仁均染色清晰；肿瘤细胞核大而清楚，异型较多，呈核分裂相；阿魏各给药组肿瘤细胞体积减小，大部分呈梭形，肿瘤细胞、核仁以及核膜出现了明显的皱缩；肿瘤细胞核固定缩紧，异型的核分裂较少，组织内出现淋巴细胞浸润。见图1，表明阿魏各给药组对肿瘤细胞有明显抑制作用，抑制肿瘤细胞增殖，细胞核出现固缩、碎裂，表现为促进肿瘤细胞凋亡作用。

(注:A:模型对照组;B:顺铂组;C:荒地阿魏高剂量组;D:荒地阿魏低剂量组;E:多伞阿魏高剂量组;F:多伞阿魏低剂量组;G:山地阿魏高剂量组;H:山地阿魏低剂量组;I:准噶尔阿魏高剂量组;J:准噶尔阿魏低剂量组)

3 讨论

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤，由于子宫颈正常上皮发生了显著的形态改变，并且在一系列的前浸润性病变，进而发展成癌。Hela细胞是从人类病变子宫内膜上分化而来的细胞，有实验研究表明其增殖和凋亡与宫颈癌预后有很大关系[9-10]。根据美国国立癌症学会公布的天然药物抗肿瘤作用指标规定，该植物的粗提物对细胞的IC50的抑制作用低于30 μg/mL，或100 μg/mL浓度其抑制增殖作用大于80%，表明该植物具有对肿瘤明显的抑制作用[11]。本研究采用MTT法求得细胞增殖抑制率及IC50，应用流式细胞术分别检测4种阿魏乙醇提取物的细胞凋亡率。结果显示，荒地阿魏、多伞阿魏、山地阿魏、准噶尔阿魏75 μg/mL浓度的增殖抑制率均大于80%，表明4种阿魏的体外抗肿瘤效果均较好；对人宫颈癌Hela细胞均具有一定的促凋亡作用。

《抗肿瘤药效学指导原则》[12]规定，当天然药物对肿瘤抑制率超过40%时，可以认为其有一定的抗癌效果，值得深入的研究。根据抑瘤率，荒地阿魏、山地阿魏和准噶尔阿魏等均具有一定的抗癌活性，符合规定。中药由于化学成分复杂，具有多靶点、多环节、多途径的作用特点，出现倒置现象，如多伞阿魏、准噶尔阿魏高剂量组的肿瘤重量大于低剂量组，表现出低剂量组的抑瘤率更好，这些有待于后续增加样本量及重复次数，以明确其较佳的剂量范围。

脾脏是机体最大的免疫应答器官，是各类免疫细胞居住的场所，胸腺是免疫系统的中心器官，主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，参与细胞免疫。本研究结果显示，模型对照组脾脏、胸腺重量显著增加(P<0.05)，说明当小鼠患上肿瘤后，触发机体免疫反应能使脾脏、胸腺增大；顺铂组脾脏、胸腺与正常对照组比较均显著下降，表明顺铂的免疫抑制作用；而新疆4种阿魏对脾脏重量无明显影响，山地阿魏和准噶尔阿魏可使胸腺重量明显减轻，是免疫抑制作用还是其他原因，有待于后续研究。

药物在抑制肿瘤的同时，其不良反应一直是抗肿瘤药物关注的热点，传统的化学药物治疗由于广泛的不良反应，如骨髓抑制、消化道反应、脱发、心脏毒性、肝肾功能的损伤备受关注，本实验同时测定了新疆4种阿魏对小鼠肝肾功能的影响，研究表明，新疆4种阿魏对宫颈癌小鼠的肝肾功能没有明显影响。由于指标单一，在后续工作中，还需要结合血清肌酐、尿素氮以及肾脏病理等指标进行进一步的研究和验证。要全面评价新疆4种阿魏的安全性，还需要结合凝血功能、血液常规及各脏器的病理检查。

综上所述，荒地阿魏、多伞阿魏、山地阿魏、准噶尔阿魏乙醇提取物具有较强的抗宫颈癌活性。