细粒棘球绦虫Innexin-unc9 基因在不同发育阶段的表达分析

黎飞海，吴 军，张文宝，杨 梅

(新疆医科大学1公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，2基础医学院生物化学与分子生物学教研室，3第一附属医院临床医学研究院省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，4新疆地方病分子生物学重点实验室，乌鲁木齐 830011)

囊型棘球蚴病(也称囊型包虫病：Cystic echinococcosis，CE)是人类误食细粒棘球绦虫虫卵而引起的一种人畜共患传染病。在2015-2020年期间世界卫生组织认为CE和泡型包虫病(Alveolar echinococcosis，AE)是被忽视的热带传染病并是需要优先采取行动的人畜共患传染病[1]。棘球蚴病分布于全球各地，除南极洲外，在所有大陆都有发现，除给畜牧业造成重大的经济损失外，还会导致公共健康问题[2-4]。

细粒棘球绦虫具有双向发育的特征[5]。在终末宿主可以发育为成虫，而在中间宿主长成包囊。体内成虫可以产生受精卵，后者具有传染性，预防此类寄生虫病关键在于切断传染源，即抑制成虫发育，抑制产生成熟的卵子。体外培养E.g的原头蚴，无犬胆汁培养其向成囊发育，有犬胆汁培养时其发育为成虫。由于体内肠道环境复杂，且体内成虫会产生成熟的卵子，易造成感染，不利于进行科学研究；而在体外，成虫不产生卵子。本研究通过体外用牛磺胆酸钠T4009(犬胆汁的主要成分之一)培养原头蚴，研究E.g发育与牛磺胆酸钠的关系，这有助于发现关键的调控基因，为犬抗E.g疫苗的研制筛选靶基因。

杨梅等[6]通过对有无犬胆汁培养的原头蚴转录组测序及差异表达基因分析发现有犬胆汁培养30 min的PSC其基因EgrG-000501300显著上调，其表达的蛋白是细粒棘球绦虫缝隙连接通道蛋白(也称内联蛋白即E.gInnexin-unc9，缩写EgInx，蛋白序列号：CDS19684.1)。提示EgInx在E.g成虫分化发育中可能起着重要作用。Innexin蛋白构成细胞与细胞之间的联系通道，无脊椎动物中的Inx蛋白在细胞膜构成半通道(hemichannel)，相邻细胞膜上的hemichannel对接形成缝隙连接(Gap junction，GJ)通道，其主要的生物功能就是提供小分子进出细胞的通道[7]。在许多物种都发现Inx基因在不同的组织和器官以及不同的发育状态其表达水平不同[8]。本研究拟采用有无T4009的单向培养基在体外平行培养原头蚴，对比分析不同时间点PSC的外翻率和发育状态；并采用RT-qPCR和Western Blotting检测不同时间点PSC的EgInx表达，为进一步研究该基因及蛋白在成虫发育分化中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1主要材料细粒棘球绦虫原头蚴采自乌鲁木齐屠宰场自然感染的绵羊肝脏包囊，胰蛋白胨(BD公司)，酵母(OXOID公司)，牛磺胆酸钠盐(T4009，Sigma公司)，琼脂粉(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)，QuantiNovaTM SYBR® Green PCR Kit(德国QIAGEN公司)，一抗(实验前期制备)，二抗：羊抗兔-HRP(Jackson)，Acr、Bis、Tris、SDS、TEMED(生工)。

1.2方法

1.2.1 PSC样本采集与培养 PSC采集与培养方法参照文献[6]，分别设置实验组和空白对照组进行原头蚴培养，实验组每100 mL培养基加入400 μL T4009水溶液，空白对照组每100 mL培养基加入400 μL生理盐水，每组设置一个重复组，共培养4瓶，每瓶500 μL PSC。培养基换液：每瓶吸取20 mL培养基，并观察PSC形态，加入预热好的培养基20 mL。收样时间为：培养前PSC、培养后30 min、3 h、1 d、3 d、7 d、10 d、14 d和17 d，分别收集10 μL提取RNA为荧光定量PCR备用，收集20 μL提取蛋白为Western Blotting检测。 样本收集处理：加入1 mL生理盐水洗涤样本，1 000 r/min离心1 min，去除上清液，立即放入液氮中速冻，再冻存于-80℃备用。

1.2.2 PSC外翻率计算 依据收样时间节点，对原头蚴形态进行观察并拍照，原头蚴外翻其形态主要表现为头节伸出体节，呈现头节和体节有明显的分节线，且活动性较强；另一种形态表现为头节缩在体节内，观察不到吸盘，其形状为圆形或椭圆形，这种形态成为原头蚴非外翻状态。在100倍视野下分别对4瓶原头蚴进行拍照，每瓶随机选取3个区域进行拍照计数，每个区域分别进行查数原头蚴的个数及外翻的个数，计数其外翻率。

1.2.3 细粒棘球蚴总RNA提取及cDNA合成 将上一步冻存的样本采用Trizol提取其总RNA，经核酸蛋白测定仪NDl000测定总RNA浓度，甲醛变性凝胶电泳检测其纯度；用纯度和完整性达到要求的总RNA为模板经反转录合成cDNA，反转录之前用DNAseI消化总RNA中残留的DNA(消化及反转录步骤按照TaKaRa反转录试剂盒说明书)，以消除DNA对后续PCR的影响。

1.2.4 荧光定量PCR(qPCR) (1)根据基因序列设计qPCR扩增引物，参照文献[9]以Eif3作为内参基因，如表1所示。(2)qRT-PCR体系配置见表2和表3。(3)qPCR上机程序设置：95℃，2 min；(95℃，0.05 s；56℃，30 s)45个循环；65℃，0.05 s；95℃，0.5 s。(4)根据QuantiNovaTM SYBR® Green PCR Kit说明书进行qPCR，反应体系为20 μL，每个样本设置3个重复，结果采用2-ΔΔCt的方法计算目的基因的相对表达量。

表1 E.gInnexin-unc9 qRT-PCR引物

表2 qRT-PCR反应体系

表3 qRT-PCR模板体系

1.2.5 Western Blotting分析E.gInnexin-unc9在不同培养阶段PSC中的表达量 提取PSC不同培养阶段样本的总蛋白，采用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度，经煮蛋白，配置凝胶，上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳，然后经转膜，封闭，EgInx抗体(1∶1 000)孵育，山羊抗兔(1∶5 000)二抗孵育，电化学发光(ECL)试剂成像获取结果。

1.3 统计学分析采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组数据比较采用t检验，数据符合正态分布，多组数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，偏态分布采用最小显著性方差分析(LSD)检测组间差异，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胆盐培养基对细粒棘球绦虫生长发育的影响各取100 μL原头蚴分别加入两种培养基中(无胆盐培养基、加T 4009培养基)分别培养，在0 min、30 min、17 d时使用倒置显微镜观察其生长和发育状况，各进行3次采图拍照并计算外翻率，每个时间段采用t检验比较两组，30min(t=5.782，P=0.029)，17d(t=24.74，P=0.002)，加T4009组与无胆盐组相比在30 min，17 d时外翻率具有差异性(P<0.05)，结果见表4和图1、2、3。

表4 有无胆盐下PSC培养不同时间段外翻率

2.2qRT-PCR分析qRT-PCR结果以PSC(0 min)作为对照，采用2-ΔΔCt相对定量的方法表示差异倍数。对于体外培养的PSC，在培养30 min时其EgInx的表达量T4009组明显高于无T4009组，且差异具有统计学意义，在17 d时，具有类似的结果，如表5所示。

表5 E.granulosus不同发育阶段EgInx相对表达量(2-ΔΔCt)

2.3Western Blotting 分析通过WB实验结果显示(图4)，PSC培养30 min 加T4009组EgInx蛋白表达量高于无胆盐组(t=9.87，P=0.006)，随着时间表达有下降的趋势，但培养到17d(t=4.92，P=0.03)，与30 min的结果类似，两者差异都具有统计学意义，如表6所示。

表6 E.granulosus不同发育阶段EgInx蛋白相对表达量

3 讨论

CE的病原体分布于全球，不同流行地区的人类疾病负担程度不同，这取决于人类行为危险因素、动物宿主组合的多样性和生态以及细粒棘球绦虫基因多样性，这种现象导致其致病潜力和严重程度存在差异[4,10]。为了更好地预防此类传染病，消除传染源(一级预防)是至关重要的，解决成虫问题成为关键所在。

体外培养成虫不仅可降低研究者风险，而且更有利于观察虫体发育形态和收集抗原物质。体外培养发现犬胆汁是E.g向成虫方向发育的必需因子，犬胆汁主要包含牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺脱氧胆酸形成的钠盐[11]。本研究首先，进行原头蚴培养及外翻检测实验，观察含与不含T4009-单向培养基平行培养的原头蚴生长发育状况，可初步得出：牛磺胆酸盐对E.g的外翻有一定的调控作用，是向成虫发育的关键因素，有证据说明PSC外翻情况可以评估E.g生长发育情况，特别是向成虫发育[6]。但含T4009培养基培养的PSC外翻率只有40%～50%，2012年有研究显示，在犬胆汁培养下其外翻率大约在50%～60%[12]。研究显示影响PSC外翻率主要因素有包囊是否可育，胆汁酸盐种类、囊液的清亮度、PSC形态的完整性和活力以及营养成分[12-13]。E.g在犬类动物小肠内发育为成虫并形成成熟的卵子，这可能与犬小肠内环境、胆盐成分及肠道微生物有关。目前，体外培养并不能模拟犬类动物小肠的微环境，初级胆汁酸经过肠道微生物代谢，会生成次级胆酸而发挥生物学作用，推测肠道微生物与胆盐共同作用E.g而影响生长发育，但这还需进一步研究证明[14]。本研究结果表明，胆盐T4009能够提高PSC外翻率，对E.g的生长发育有着重要的作用；但胆盐是如何调控E.g生长发育的，有哪些基因和通路参与尚不清楚，有待进一步研究。

依据前期转录组结果分析，犬胆汁上调细粒棘球绦虫缝隙连接蛋白表达[6]，本研究除了验证了体外PSC向成虫发育需要胆盐T4009的参与，且研究了PSC在体外由牛磺胆酸盐诱导下其缝隙连接蛋白基因在不同培养节点的表达情况。

缝隙连接蛋白(Innexin, Inx; Connexin, Cx和Pannexin, Px )存在于无脊椎和脊椎动物体内并构成细胞之间的缝隙连接，其生物学功能主要表现在细胞间信号交流、物质运输、生长分化等方面[7，15-16]。在无脊椎动物中，缝隙连接通道存在广泛，这些通道是由多种类型的内联蛋白构成，包括经典的模式生物线虫和果蝇[17-19]。对于寄生虫，Inx表达与其生存息息相关，可维持细胞结构完整性和调控宿主免疫反应；由于Inx位于寄生虫界面上，具有免疫原性，所以寄生虫的Inx蛋白是开发治疗寄生虫病新药和研制抗虫疫苗的潜在靶点[20]。

Inx蛋白的研究在许多物种都有报道，特别是在果蝇和秀丽线虫，这类蛋白在这两种生物体内的结构和细胞定位及生理功能基本一致[17, 21]；这种现象说明Inx蛋白在生物界相对保守，这为研究其他生物的Inx蛋白提供了科研思路。相较于线虫，细粒棘球绦虫Inx蛋白研究较少，Inx蛋白在细粒棘球绦虫中的表达和功能未见报道。本研究通过RT-qPCR和Western Blotting实验，对体外有无T4009分别培养的PSC持续检测，发现有T4009刺激下，30 min和17 d时与无T4009组相比EgInx表达上调，差异有统计学意义。Inx蛋白在黑翅菌蝇(Rhynchosciara angelae，Ra)、线虫和青蟹的不同生长发育时期和部位其表达水平存在差异[22-25]。对于体外培养的细粒棘球绦虫PSC，培养前期是快速发育阶段，当PSC从囊液转移至培养基30 min时，受到外环境胆盐的刺激，激活PSC发育调控机制，促进EgInx高表达，可能通过形成缝隙连接通道为E.g提供更多的营养物质和ATP，加速E.g身体蠕动(头节外翻运动)和生长发育，这一系列生理活动需要消耗大量的ATP。30 min和17 d时有T4009组EgInx表达量升高，提示体外培养的E.g存在关键的发育节点，除了PSC从囊液初转移至培养基时以外；随着培养时间延长，在两周之后是幼虫长出第二个节片的关键时期，虫体发育较快，节片向后延伸，这个时期也需要更多的细胞间交流和物质传递，而EgInx形成的缝隙连接通道可能更有利于此过程的发生。

对于目前的研究还不够成熟，如成虫培养，虽然牛磺胆酸盐T4009能够促进原头蚴发育为成虫，但只有50%左右，而其他成为包囊或死亡，是否存在其他影响因素，这还需要进一步研究。Inx是一个超家族蛋白，在其他物种发现多种类型，而在细粒棘球绦虫是否存在其他类型的Inx蛋白，它们之间的联系还需进一步探究。通过上述研究结果提示，EgInx表达对T4009诱导的细粒棘球绦虫成虫发育可能起着重要的作用，细粒棘球绦虫自身不能合成胆盐，需要吸收外环境胆盐，这类小分子是否通过Inx形成的通道而进入体内发挥调控作用还需进一步研究。