CAR-T细胞治疗在急性髓系白血病中的研究和应用进展*

肖植文 喻敏 李菲

近年来，已出现较多急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）治疗的新药，这些新药给予复发/难治性患者获得再次缓解的机会，但在年轻复发AML 的预后评估中，高危患者占比约为66%，而5 年总生存率 （overall survival，OS）仅为4%[1]，提示有必要探索治疗复发难治性AML 的其他有效方案。 在其他血液学肿瘤免疫疗法治疗成功案例的推动下，嵌合抗原受体修饰T 细胞 （chimeric antigen receptor Tcell，CAR-T）免疫疗法已在部分复发/难治性AML 患者的治疗中得到了应用。

1 嵌合抗原受体的基本结构及其作用

嵌合抗原受体 （CARs）是一种人工合成的受体，可以引导淋巴细胞识别并消除表达同源靶向配体的细胞。CARs 由胞外靶向连接区、铰链区、跨膜区、胞内信号转导区4 个部分组成。胞外靶向连接区是CART 细胞外部，其识别目标抗原并改变CARs 表达的淋巴细胞的特异性。胞外靶向连接区主要是由单克隆抗体的重链可变区 （VH）和轻链可变区 （VL）通过连接肽 （linker）连接而成的单链可变片段 （single-chain variable fragment，scFv）[2]。铰链区起着连接CAR 的外结构域和跨膜结构域的作用。跨膜区主要是由Ⅰ型膜蛋白衍生出来，如CD3、CD4、CD8 或CD28。胞内信号转导区主要是由1 个或多个共刺激因子 （costimulatory molecule，CM）和1 个激活域组成[3]。常用的共刺激因子是以CD28 为代表的B7 家族和以4-1BB 为代表的肿瘤坏死因子受体家族。其中具有CD28 结构域的CAR-T 细胞具有更高效、更快速的细胞毒能力，具有4-1BB 共刺激域的CAR-T 细胞在患者体内保留时间更长[4]。

2 CAR-T 治疗AML 的临床应用靶点

2.1 CD33-CAR-T

CD33 在几乎90% 的AML 病例中表达于白血病细胞亚群，包括白血病干细胞，以及一些正常的髓系祖细胞。CD33 为AML 免疫治疗的1 个具有吸引力的靶点。解放军总医院对1 例复发难治性AML 患者开展的临床试验[5]，在输注总计1.12×109CD33-CART 细胞后，2 周后骨髓原始细胞明显减少，由原先＞50%下降至＜6%，却在第3 周开始上升至22%，第5周为27%，第9 周接近70%，疾病逐渐加重，患者直至第13 周死亡。美国安德森癌症中心报道的Ⅱ期临床试验中[6]，3 例接受抗CD33-CAR-T 输注治疗的患者中，2 例患者分别发生3 级和2 级细胞因子释放综合征 （cytokine release syndrome，CRS），1 例发生2 级免疫效应细胞相关神经毒性综合征 （immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）。最终3 例患者在1 个月内均因疾病进展而死亡。由于CD33 不仅在白血病细胞上表达，而且在几乎所有健康的髓细胞和祖细胞上表达，CAR-T 细胞治疗不良反应 （包括CRS、ICANS）是临床前实验和CD33 靶向治疗临床试验中不可回避的问题，也是目前临床应用需要克服的难题。Liu 等[7]构建出第3 代CD33-CART 在体外实验中表现出较长的持久性及较小的细胞毒性，但还需更多的临床前实验验证其效果。

2.2 CD123-CAR-T

CD123 在AML 中表达也相当普遍，60%～80%的AML 细胞高表达CD123，但在正常造血干细胞中表达水平较低或不表达。CD123 也是非常具有吸引力的治疗靶点。在CD123 重定向CAR-T 细胞治疗AML 的临床前研究模型中显示，抗CD123-CAR-T 会导致正常造血细胞显著减少[8]。Sun 等[9]报道了单例患者在使用抗CD123-CAR-T 细胞治疗后最终实现了完全缓解 （complete response，CR）。在输注后第6 日，患者骨髓造血干细胞从38% 降至8%，第18 日行异基因造血干细胞移植，第42 日完成异基因造血干细胞移植但仍未脱离血小板及红细胞输注，于第56 日死于急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，GVHD）、重症肺炎、多器官功能衰竭。目前，研究肯定了抗CD123-CAR-T 细胞在AML 患者中的治疗效果，但仍提出了血液学毒性的问题。有研究通过构建以CD28 为共刺激域并结合zeta 信号结构域的CD123-CAR-T 具有较好的安全性及有效性[10]。

2.3 CLL-1-CAR-T

C 型凝集素样分子 （C-type lectin-like molecule-1，CLL-1）是Ⅱ型跨膜糖蛋白，起抑制受体的作用。白血病干细胞 （leukemic stem cell，LSC）被认为是AML治疗失败和复发的主要原因。CLL-1 在LSC 中低表达及存在个体差异表明CLL-1 并非1 个通用的LSC标记，但是CLL-1 在正常的造血干细胞和非造血组织表达中有限，预测CLL-1 将会是某些亚组患者的较好靶点，需要根据个体化的表达水平来选用CLL-1 靶点进行治疗。动物模型中显示，抗CLL-1-CAR-T 细胞对CLL-1 阳性的AML 动物具有治疗效应，但由于CAR-T 细胞持久性不足而复发[11]。有研究报道3 例儿童AML 患者接受抗CLL-1-CAR-T 细胞治疗后，均达到了完全缓解（complete response，CR），并接受了造血干细胞移植，提示抗CLL-1-CAR-T 细胞可能能为某些白血病患者提供后续造血干细胞移植的机会[12]。目前认为抗CLL-1-CAR-T 细胞安全性良好，不具有造血干细胞靶向的潜在毒性。

2.4 CD19-CAR-T

AML 中CD19的异常表达通常与t（8;21）（q22;q22）相关，未出现染色体易位的AML 及混合表型急性白血病也可有CD19 异常表达，已有临床前研究报道抗CD19-CAR-T 细胞对CD19+AML 细胞具有杀伤力和应用潜力。有研究报道2 例t（8;21）CD19+AML 男性患者接受抗CD19-CAR-T 细胞治疗的案例[13]，1 例患者在接受抗CD19-CAR-T 细胞治疗后达到细胞形态学缓解 （morphological CR,mCR）持续10 个月，另1例患者在接受抗CD19-CAR-T 细胞治疗后达到血液学缓解 （hematological CR,hCR）和mCR。在接受CD19-CAR-T 细胞治疗后，2 例患者AML 细胞中CD19+占比分别从40.1% 和22.6% 下降至14.3%和6.5%。患者因经济原因拒绝进一步治疗，最终于抗CD19-CAR-T 细胞治疗后第3 个月复发，于第5 个月死亡。2 例患者都曾出现短暂的4 级血细胞减少，随后很快恢复。有研究同样报道1 例复发难治性AML男性患者[14]，流式细胞术证实CD19 异常表达，在接受抗CD19-CAR-T 细胞治疗后第28 日达到临床和分子学缓解，4 个月后仍持续缓解。提示CD19-CAR-T 细胞治疗效果尚佳，但由于病例数较少，还需要更多的临床试验来证实。

2.5 NKG2D-CAR-T

NKG2D 配体表达在包括AML 在内的多种恶性肿瘤中，但在正常成人组织中未广泛表达。Marofi 等[15]研究显示7 例接受抗NKG2D-CAR-T 细胞治疗的AML 患者中，2 例患者疾病稳定超过1 年，2 例患者疾病稳定6 个月后进展，3 例患者仅改善了症状在6个月之内陆续死亡。在另外一项临床试验中[16]，12 例复发难治性AML 患者接受抗NKG2D-CAR-T 细胞治疗后，仅2 例患者达CR 时间超过3 个月，并在之后行异基因造血干细胞移植，持续CR 时间超过28 个月，5 例患者在3 个月之内疾病进展，3 例患者因其他原因死亡，2 例患者病情稳定。由于在AML 患者中NKG2D 配体的表达差异性较大，抗NKG2D-CAR-T细胞对AML 患者治疗效果还有待于进一步观察。

2.6 LewisY

Lewis 抗原在多种上皮来源的肿瘤中过度表达，在早期髓系祖细胞和相应的CD34+白血病细胞系也有表达。在一项早期抗LewisY-CAR-T 细胞治疗的Ⅰ期研究中显示[17]，接受抗LewisY-CAR-T 细胞治疗的4 例AML 患者中，3 例患者在接受CAR-T 细胞输注时有微小残留病灶 （minimal residual disease，MRD）的依据，输注后49 天、5 个月、23 个月后疾病进展。所有患者均未观察到3 级或4 级不良反应。虽然仅观察到有限的疗效，但这项研究表明CAR-T 细胞可以在AML 患者体内有治疗效果且无明显不良反应。

2.7 CD38-CAR-T

CD38 在大多数AML 细胞上表达，但在健康的人类造血干细胞上不表达。因此，CD38 是治疗AML的潜在靶点。一项临床试验显示[18]，在6 例异基因造血干细胞移植后复发且接受多组抢救治疗均无效的CD38+AML 患者中，4 例患者在第4 周达到了CR，其中1 例CR，3 例伴骨髓恢复不完全的完全缓解（CR with incomplete count recovery，CRi），1 例患者无反应，1 例疾病进展。4 例CR 患者中，其中2 例患者复发，1 例于117 日后复发，予以抗CD38-CAR-T 细胞治疗后再次CR，1 例患者死亡。6 例患者中位总生存期和无白血病生存期分别为7.9 个月和6.4 个月。

3 CAR-T 治疗AML 的潜力靶点

Fms 样酪氨酸激酶3 （FLT3）是AML 中最常见的基因突变之一，约占AML 病例的30%。Wang 等[19]的研究显示，抗FLT3-CAR-T 细胞在体外有很强的FLT3+AML 细胞杀伤能力，能延长AML 小鼠的生存期且不会损伤健康的造血干细胞。Shrestha 等[20]的研究也显示了同样的结果。CD44 是一种跨膜蛋白，CD44v 是CD44 的一种亚型，仅在上皮细胞及造血细胞亚群上表达。早期一项研究显示抗CD44v6-CART 在体外及小鼠体内对AML 细胞均有杀伤效果，而对造血干细胞没有影响，仅单核细胞减少[17]。叶酸受体β （folate receptor β,FRβ）表达于髓系造血细胞，在70%AML 中表达。Ghamari 等[21]已经证实叶酸受体β 为AML 治疗的潜在靶点，抗FRβ-CAR-T 细胞在体外及小鼠体内均具有抗白血病效果，且未发现造血干细胞毒性。

4 复合CAR-T 在AML 中的应用

构建这种双CAR 的主要目的是减少由于克隆逃逸丢失一个靶向抗原而导致的复发机会。一项实验室研究发现CD33-CLL-1 组合靶向是儿童AML 中最有前途的靶向组合[22]。体外实验显示，抗CLL-1-CD33 CAR-T 对CD33 或CLL-1 阳性的细胞株以及AML患者的原发性白血病样本具有特异性的抗肿瘤活性。Hazelton 等[23]进行的一项首次在人体内进行的Ⅰ期临床试验，将抗CLL-1-CD33CAR-T 细胞用于1 例6岁复杂核型并对多种治疗耐药的AML 女性患者，治疗安全且耐受性良好，在注射CAR-T 细胞治疗后第19 日骨髓穿刺显示MRD阴性。在第44 日接受异体干细胞移植后达到CR。

基于上述研究数据，双靶点治疗策略以防止抗原下调已被证明是有效的。但无证据表明双靶向CAR会增加CAR-T 细胞相关不良反应的临床发生率，由于可用数据有限，不能排除这种可能性。

5 CAR-T 细胞治疗的不良反应

CRS 是CAR-T 细胞治疗最常见的不良反应，主要由细胞因子过度释放引起。CRS 的临床症状表现为发热伴疲劳、关节痛、僵直等，然后迅速进展为低血压、心动过速、缺氧等。发热通常是CRS 的首要和最必须的症状。目前，认为早期应用托珠单抗 （tocilizumab）可以降低严重CRS 的发生率，而不影响CAR-T细胞，或是使用大剂量皮质类固醇激素通过抑制CART 细胞和旁路免疫细胞来缓解[24]。ICANS 可与CRS同时发生，也可独立于CRS 发生。可表现为谵妄、昏迷、癫痫、脑水肿。目前，对ICANS 发生机制了解较少。类固醇激素是一线治疗，托珠单抗对血脑屏障穿透力较差，在解决神经毒性方面疗效较差[25]。

6 结语

在B 细胞恶性肿瘤中，CAR-T 细胞取得较好的疗效，但CAR-T 对AML 的治疗价值仍未确定。寻找合适的具有低非靶向毒性的靶点和减少非靶向毒性是目前应用CAR-T 治疗AML 面临的挑战。在已有的具有低毒性靶点上可进行更多的动物实验来进一步明确治疗效果及安全性。在减少非靶向毒性上可以做更多的尝试，如在CAR 中植入自杀基因、构建临时表达的CAR、提高CAR 的亲和力与复合CAR 的选择。