陡脉冲不可逆电穿孔技术(纳米刀)发展历史回顾

田锦林，肖越勇

(1.厦门市第三医院介入科，福建 厦门 361100；2.中国人民解放军总医院第一医学中心放射诊断科，北京 100039)

早在2800多年前，古希腊人发现随身佩戴的琥珀经摩擦后可吸附羽毛或木屑，并将此现象称为“amber(琥珀)现象”。“电(electricity)”一词直到2 000多年后的20世纪初方才出现，此时原子结构被发现，对于电的起源和原理也有了比较准确的书面定义。电是电子运动所产生的自然现象，为自然界4种基本相互作用(万有引力、电磁相互作用、强相互作用及弱相互作用)之一。细胞电穿孔现象是电对生物作用领域的重大发现。不可逆电穿孔(irreversible electroporation， IRE)技术亦称纳米刀，是消融肿瘤的新模式，本文对其发展历史进行简要概述。

1 纳米刀问世前

1.1 电穿孔技术发展第一阶段(18世纪至20世纪初)：初步认识电穿孔现象 1754年，法国物理学家、牧师NOLLET发现，在电场中向人或动物的皮肤施加电火花，将会使局部产生一个红点，即NOLLET红点，并建议以IRE来加以定义[1]。1777年，德国物理学家LICHTENBERG以高压粒子加速器作用于玻璃而引出闪电，形成的美丽图案被称为“LICHTENBERG图案”[1]；人遇到雷电击伤而未死亡时，皮肤上会留有富有特征性的利希滕贝格图案，并在其后数天内消退。LICHTENBERG图案与NOLLET红点具有相同的发生机制，均为皮肤被电击穿导致毛细血管通透性增加、使血液中的红细胞漏出血管进入皮肤浅层所致。1898年，有研究者发现多次以高电压放电能够杀灭水中的细菌，其所用电脉冲仅持续数分钟，而在这一过程中水温并未升高，故认为杀菌作用机制极有可能是IRE[1]。1913年，有研究[1]认为，电热效应导致的烧伤是工业电击事故最常见的致死原因，但并非雷电击伤的主要致死原因。上述这些研究使人们初步认识到电穿孔现象。

1.2 电穿孔技术发展第二阶段(20世纪中叶至21世纪初)：电穿孔机制探索及应用 在此阶段的早期20年(1951年—1970年)间，细胞电穿孔机制研究主要关于IRE，但此时尚未掌握可逆性电穿孔(reversible electroporation, RE)的发生条件，不能实现细胞电穿孔后恢复，电穿孔发生程度和范围尚不可控。在食品加工领域，IRE被称为“脉冲电场处理”或细胞质电溶解，用于提取液体中内容物或杀灭液体中的细菌。这一阶段形成的共识包括：①电场具有杀菌作用；②高场直流电脉冲能杀灭细菌而不产生热效应；③与杀菌有关的参数包括电场强度和外加电场作用时间，前者是完全杀灭细菌的最关键因素；④电脉冲可致细胞膜不可逆性击穿，改变细胞膜的通透性，从而导致非致热性细胞溶解。

在1971—1990年这20年间，RE技术取得重要进展，其发生机制被阐明，使之成为生物科技及医学领域的重要应用技术之一。1982年，细胞融合技术及细胞内基因导入技术的出现，将RE技术推向生物科技及医学发展前沿。OKINO等提出RE可用于肿瘤电化疗(electrochemotherapy)。1984年POTTER应用电穿孔技术实现了基因转染。NEUMANN于1989年编写了专著《电穿孔技术和电融合技术在细胞生物学中的应用》，标志着细胞RE机制已经明确。从20世纪90年代到21世纪，RE已被广泛应用于细胞生物学及分子生物学领域，如活体组织DNA质粒导入、活体细胞内基因转移等，相关经验和理论更加成熟；同时，对于IRE的作用机制有了更明确的认识，即电穿孔导致细胞膜过度通透或超范围通透可破坏细胞内外渗透压平衡，导致细胞死亡和/或凋亡[1]。

1997年，SCHOENBACH等首次报道了极高电压脉冲、纳秒级脉冲电场(nanosecond pulsed electric field, nsPEF)超短脉冲可致细胞内膜穿孔(如线粒体膜)[1]。此后电脑模型及实验研究结果显示，nsPEF可使细胞膜结构穿孔，并称这种现象为超电穿孔。在高电场下采用nsPEF可诱导细胞凋亡，具有抑制肿瘤生长作用[1]。上述研究进一步明确了IRE机制，为后续将其用于肿瘤消融奠定了基础。

2 纳米刀问世后

2.1 IRE问世及临床前期研究 2004年，YAO等[2]受到nsPEF系列研究结果的启发，应用一种特殊脉冲，即陡脉冲电场(steep pulsed electric field， SPEF)来杀灭肿瘤细胞，以实现体内抑制肿瘤：通过1个电容放电获得由1个快速上升(上升时间200 ns)支和随后1个缓慢的呈指数下降(约200 μs)支组成的SPEF脉冲，以高频脉冲的上升坡度所造成的细胞内膜结构破坏及低频脉冲下降坡度所导致的细胞外膜结构破坏相结合，达到同时破坏细胞核、细胞器及细胞膜的效果。2005年，DAVALOS等[3]就IRE用于组织消融申请了美国发明专利，此举标志着IRE技术即将应用于肿瘤消融。

针对IRE用于消融肿瘤进行了大量动物实验研究。2007年，RUBINSKY等[4]发现以IRE消融猪的肝脏后，消融区肝细胞出现核固缩及空泡变性，而大血管结构保持完整。2008年，MAOR等[5]对大鼠颈动脉进行IRE消融，消融后血管结缔组织基质保持完整，血管平滑肌细胞数量明显减少，提示IRE可安全用于消融邻近大血管的病灶及血管平滑肌异常增殖性病变(如血管再狭窄及动脉粥样硬化)。2007年，ONIK等[6]对犬前列腺肿瘤进行IRE消融，效果较好且未损伤邻近尿道、血管、神经和直肠等组织，表明其安全性较高。

2008年，第一台获准用于消融软组织的IRE治疗仪在美国问世，商品名：纳米刀(NanoKnifeTM)。该设备由一台高压脉冲发生仪及若干单一用途的一次性电极针组成，开启了IRE肿瘤消融领域，是IRE发展史上的里程碑。此后相继展开IRE用于人体离体实验、免疫相关及麻醉配合等方面的研究，为IRE用于临床提供了基础。RUBINSKY等[7]将IRE用于体外消融前列腺癌，发现IRE消融对前列腺癌组织的杀灭作用较彻底。TEKLE等[8]发现IRE可致细胞膜磷脂酰丝氨酸外露，使吞噬细胞将其吞噬而加以清除。上述研究证实，IRE不损伤富含结缔组织骨架的结构如血管、胆管、输尿管及神经等，或虽损伤但易于修复，为IRE用于临床打下了坚实基础。

但是，IRE消融仍存在一定安全隐患。BALL等[9]以IRE消融21例患者的恶性肿瘤，发现患者上半身肌肉在放电过程中发生广泛收缩，需应用神经肌肉阻滞剂，部分患者出现自限性室性心律失常，术中需应用心电同步门控技术。

2.2 纳米刀在美国获批应用于临床及国外临床应用进展 2011年10月24日，IRE获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)510(K)认证，批准用于软组织消融，成为其发展史上又一里程碑。

大量IRE消融肿瘤的临床回顾性、前瞻性研究相应展开，初步验证了该技术的安全性和有效性。THOMSON等[10]进行的单中心、前瞻性、非随机阵列研究纳入了38例晚期肝癌、肾癌及肺癌患者共69个病灶，结果显示IRE消融效果好且并发症少。随后数年数项临床研究[11-15]将IRE用于消融其他脏器肿瘤，均获得良好治疗效果。同时，多项动物实验[16-17]进一步验证了IRE的安全性和有效性。

2.3 国内引进纳米刀及设备国产化 国内关于陡脉冲对细胞IRE方面的基础研究[18]报道始于2004年。2014年，中国人民解放军总医院第一医学中心、广州复大肿瘤医院等进行的IRE治疗肿瘤的前期基础研究及临床研究，为纳米刀在国内获批临床应用奠定了基础。我国国家药品监督管理局(原国家食品药品监督管理局)于2015年6月18日批准将IRE治疗仪用于临床，适用范围主要为肝肿瘤和胰腺肿瘤，标志着IRE消融技术已正式进入我国。

国内引进IER技术后，首先进行了大量动物实验[19-24]，进一步验证其安全性和有效性；随后开展的初期临床主要针对胰腺及肝肿瘤，消融途径包括开腹、腹腔镜下消融及CT引导下经皮穿刺消融。针对肝脏的初步IRE临床研究结果显示，对于靠近大血管、胆囊等重要结构的肝肿瘤，IRE消融安全、短期疗效好，值得临床推广；而对于进展期胰腺癌，IRE消融中及消融后均未出现治疗相关胆漏、大出血、深静脉血栓或胰漏等严重并发症[25-26]，偶见严重心律不齐，术中麻醉医师可予处理，总体风险可控。另一方面，IRE消融费用昂贵，限制了其在国内推广应用，纳米刀设备国产化迫在眉睫！

2021年7月5日，我国首台自主研发的IRE设备在国内获批上市，标志着我国IRE技术进入了新的发展阶段。国产化设备的出现，必将打破目前国外同类产品的垄断地位，大幅降低成本，利于IRE消融技术在我国推广应用，为广大肿瘤患者带来新的治疗选择和希望，并由此进一步加快IRE设备的国产化进程[27-30]，促进IRE消融技术在我国蓬勃发展，使更多患者受益。