食品中合成色素和违禁染料色谱检测的分析研究

◎ 沈昌莹，苏骏敏，张树权，莫淑梅

（东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808）

色泽是影响人们选择食品的重要因素。天然色素由于其对光、热、酸和碱等因素敏感，所以在加工、贮存过程中易褪色和变色，影响食品的感官性能[1]。目前，在食品生产过程中，大多数商家因天然色素成本较高而选择使用合成色素，也有部分商家使用食品违禁染料给食品着色。合成色素主要是指偶氮类化合物，如柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红和日落黄等和非偶氮类化合物，如亮蓝、赤藓红等常用于食品着色的人工合成有机色素，违禁染料主要是指罗丹明B、苏丹红Ⅰ～Ⅳ、酸性橙Ⅱ等不得用于食品着色的工业染料[2]。

与天然色素相比，合成色素和违禁染料具有价格低、着色稳定、易获取等优点，但其具有毒性，尤其偶氮类合成色素的致癌作用明显，其化合物在人体内分解，形成的芳香胺代谢后与靶细胞作用，形成肿瘤[3]。当人体摄入大量的合成色素时，还会出现嗳气、偏头痛、多种过敏症状和中毒等症状以及影响儿童的智力，导致儿童IQ值下降[4-6]。违禁染料主要适用于溶剂、油、蜡和汽油增色以及鞋、地板等的增光，多为可诱发人体癌变，引发人体皮肤、黏膜或呼吸道过敏的致癌和致敏染料[7]。由此可见，合成色素和违禁染料的滥用都会严重损害消费者的生命健康。目前，各检测机构主要使用色谱方法对食品中的合成色素和违禁染料进行检测，而且对检测结果进行判定的依据比较明确。对于合成色素，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中限定了其在不同食品中的使用量；对于违禁染料，食品整治办〔2008〕3号和整顿办函〔2011〕1号中列出的食品中可能违法添加的非食用物质名单中明确指出罗丹明B、苏丹红、酸性橙Ⅱ等不得在食品中添加。商家在食品生产过程中是否会依据相应法律法规和标准规定使用合成色素和违禁染料，还需要检测机构确保检测过程的准确、稳定、可重复和灵敏度。本文针对目前的检测形势和需求，从自身的检测经验出发，综合参考其他研究文献，综述食品中合成色素和违禁染料色谱检测的研究进展，为检测人员改善检测方法提供参考。

1 检测方法

目前，常用于食品中合成色素检测的标准方法主要是《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）、《肉制品 胭脂红着色剂测定》（GB/T 9695.6—2008）和《食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效液相色谱法》（SN/T 1743—2006）。常用于食品中违禁染料检测的标准方法主要是《进出口食品中罗丹明B的检测方法》（SN/T 2430—2010）、《食品中罗丹明B的测定》（BJS 201905）、《出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》（SN/T 3536—2013）和《食品中苏丹红染料的检测方法》（GB/T 19681—2005）。在实际开展检测时，各个标准方法常用于检测的食品类型见表1。

2 合成色素

2.1 样品前处理与分析检测

2.1.1 GB 5009.35—2016中合成色素的测定

合成色素的标准检测方法中常用聚酰胺吸附法，其原理是利用聚酰胺粉在酸性条件下对色素有比较好的吸附性，吸附样品提取上清液中的色素，倒入G3砂芯漏斗中抽滤，用热的pH=4的水溶液或柠檬酸溶液淋洗聚酰胺粉，洗去聚酰胺粉中的糖等杂质，再用甲醇-甲酸溶液洗去聚酰胺粉中可能吸附的天然色素，水洗聚酰胺粉至中性后，用乙醇氨水溶液将聚酰胺粉吸附的合成色素解吸附，得到纯化的合成色素提取溶液，由于赤藓红溶于甲醇，使用甲醇-甲酸混合溶液进行色素洗脱，很容易将样品中的赤藓红除去，因此《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）中还针对含有赤藓红的样品提出了液-液分配法，其原理是用三正辛胺-正丁醇溶液提取合成色素，经饱和硫酸钠溶液洗涤，用正己烷和氨水溶液进行液-液分配得到纯化的合成色素溶液。这两种方法都是在配备了二极管阵列检测器的高效液相色谱仪中测定，利用得到的光谱图和校正曲线能准确地进行定性与定量。在用《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）中的聚酰胺法测定合成色素时，由于后续需要在G3砂芯漏斗中抽滤，因此需要先获得样品的上清水溶液，而液体状的饮料、经稀释的饮料浓浆、糖果（硬质糖果、压片糖果、硬质型奶糖和淀粉软糖等）和蜜饯等的提取液经高速离心后都能取得比较清澈的上清液，而高蛋白固体饮料的水提取溶液经高速离心，用柠檬酸溶液调节pH值后，又会出现浑浊现象，如果此时用聚酰胺粉吸附后用G3砂芯漏斗抽滤，G3砂芯漏斗在抽滤时很容易被堵塞导致实验难以继续进行，根据施正华等[8]、邓国龙等[9]利用等电点沉淀法使蛋白质沉淀的研究，高蛋白固体饮料的水提取溶液虽然经高速离心，但是上清液中仍存在大量蛋白质，用柠檬酸调节pH值并加热后，蛋白质发生了沉淀反应。因此，在测定高蛋白固体饮料中的合成色素时，在加水提取固体饮料后，先用柠檬酸调节pH并加热，再经高速离心，再在G3砂芯漏斗中抽滤时，可以明显改善抽滤效果。在用《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）中的液-液分配法测定合成色素时，检测人员出现回收率低和精密度差的情况，这与三正辛胺试剂的纯度有关，试验证明三正辛胺试剂的纯度影响提取效果，纯度高时提取合成色素效果好，因此在配制三正辛胺-正丁醇溶液溶液时应尽量选择色谱纯及以上纯度[10]。此外，还应在每次提取时都加入盐酸，能明显提高提取效率，若只在第一次提取时加入，后续提取时不加入，则要分液多次才能提取完全，而在每次提取时都加入盐酸，分液次数减少亦可提取充分；若采用标准方法进行多种合成色素分析测定时，出现柠檬黄和新红的目标峰分离效果差的情况，可以尝试改用Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱[11]或者TechMate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，柠檬黄和新红的分离度得到改善并且不影响其他合成色素的分离。

2.1.2 GB/T 9695.6—2008中胭脂红的测定

在使用GB/T 9695.6—2008第一法测定肉制品中的胭脂红时，在肉制品中加入预处理好的海砂研磨，用石油醚除脂后用乙醇氨水溶液多次提取，提取液经过浓缩后加入硫酸溶液和钨酸钠溶液沉淀蛋白质，再用聚酰胺粉吸附，经G3砂芯漏斗淋洗和洗脱，洗脱液蒸至近干后定容得到上机溶液。由于肉制品中含有油脂，不除油脂会导致G3砂芯漏斗堵塞，因此整个实验过程烦琐，不利于批量化检测，而且实验过程对石油醚的用量大，究其原因是除油脂效率低；在赵海峰等[12]的研究中，加入石油醚与肉制品提取液混合，经冷冻离心除去脂肪；在实际检测时，发现低温对肉制品提取液除脂效果好，因此称取肉制品样品至离心管后，加入乙醇氨水溶液振荡提取，可以将离心管放置在4 ℃冰箱中过夜或放置在-20 ℃冰箱中1 h，再经离心机在4 ℃条件下高速离心，最终得到的提取液中油脂含量大量减少，在后续使用G3砂芯漏斗抽滤时，不会发生堵塞，节约了前处理的时间和石油醚的使用；肉制品中胭脂红的检测还需要考虑特殊样品的均匀提取问题，如猪鞭或含筋较多、韧性强的肉制品等，普通的碎样机器无法将其打碎，而且普通碎样机器长时间碎样会导致样品温度升高，得到的待测样颗粒仍比较大，可以使用液氮粉碎机碎样，其可以将肉制品冷冻到质地变脆再碎样，粉碎细度可以达到100～300目或更细，从而保证样品的均匀性。

2.1.3 糖果中合成色素的测定

在使用GB 5009.35—2016和SN/T 1743—2006检测糖果中的合成色素时，需要关注特殊样品如胶基糖果、多种颜色的凝胶糖果和棉花糖等，这些类型的样品在碎样时会出现样品不均匀的情况，因此也可以使用液氮粉碎机碎样，称样后加水加热溶解提取，再经离心除去胶基等杂质，保证样品均匀性的同时减少对后续的提取和纯化的影响。

2.2 检测方法比较与适用性

合成色素常用的标准检测方法以聚酰胺法和液-液分配法为主，相对标准偏差一般都在10%以内。其中GB 5009.35—2016适用的食品类型多，但除了液体饮料、饮料浓浆和糖果等基质中的合成色素普遍回收率可达到80%～110%，其他基质的合成色素回收率普遍在50%～80%，而且对含有赤藓红的样品，要另采用液-液分配法，增加了批量检测的时间。SN/T 1743—2006的步骤相对简单，但只适用于饮料和糖果，虽然用在检测酸性红、日落黄时回收率可达到80%～100%，但亮蓝回收率为60%～70%。用GB/T 9695.6—2008可以测定肉制品中的胭脂红，但是胭脂红的回收率为60%～80%。若以80%的回收率判定方法回收高低，则标准方法仍需进一步优化。

目前，关于合成色素检测方法的研究众多，陈连梅等[13]建立了固相萃取-HPLC法同时测定肉制品中苋菜红、胭脂红、日落黄和诱惑红含量，样品用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液2次提取肉制品中的合成色素，加入水饱和正己烷与提取液混合后经浓缩除去脂肪，经P-WAX固相萃取柱净化进行测定，各组分分离好，回收率为66.7%～99.7%，相对标准偏差为1.9%～3.6%，其中胭脂红的回收率为82.4%～99.7%，比GB/T 9695.6—2008的实际回收率高，可检测的合成色素多了3种，但该方法同样只适用于肉制品。林芳等[14]建立了固相萃取（SPE）-超高效液相色谱法同时测定蜜饯中9种合成色素，样品用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液多次提取肉制品中的合成色素，80 ℃水浴氮吹浓缩后经混合型阴离子交换柱净化，用2%氨化甲醇（V/V）洗脱，洗脱液在50 ℃水浴氮吹至近干后，加水复溶进行测定，根据合成色素出峰时间分成4组，分别采用适合的波长进行测定，9种合成色素的回收率为80.1%～98.6%，相对标准偏差为1.8%～4.3%，比GB 5009.35—2016的实际回收率好，可检测的合成色素多了2种，并且同一种前处理方法适用于赤藓红的检测，但是该方法仅适用于蜜饯的测定。刘丽等[15]建立了QuEChERS-HPLC快速测定食品中7种食用合成色素，样品采用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）提取，混合使用C18和PSA两种基质分散净化剂净化，离心后取10 mL上清液用冰乙酸调节pH至中性后蒸发至近干，加水复溶得到待测液，分2组采用2种检测波长进行测定，平均回收率在83.01%～109.65%，相对标准偏差4.64%～15.23%，该方法相比国家标准方法极大缩短了样品前处理时间，节约人力，采用可见区波长检测，减少干扰，综合性强，但仅适用于豆制品和肉制品，且比GB 5009.35—2016少了新红的测定。

3 违禁染料

3.1 样品前处理与分析检测

3.1.1 SN/T 2430—2010中罗丹明B的测定

SN/T 2430—2010检测辣椒、辣椒粉、辣椒油中的罗丹明B，原理是用乙酸乙酯-环己烷（1+1，V/V）提取样品中的罗丹明B，经过凝胶色谱净化系统净化，洗脱液经40 ℃旋转蒸发至近干，用甲醇复溶后使用高效液相色谱-荧光测定，若检出则用40%甲醇水复溶后使用高效液相色谱-质谱/质谱确证，凝胶渗透色谱系统使用前后应用乙酸乙酯-环己烷（1+1，V/V）清洗凝胶色谱柱，避免残留杂质的影响，多样品同时净化要注意收集流出液的时间，时间过短会导致损失，时间过长会影响净化效果。

3.1.2 BJS 201905中罗丹明B的测定

BJS 201905检测花椒、花椒粉、花椒油和半固体调味料中的罗丹明B，原理是用含0.1%甲酸的甲醇水溶液提取，提取液经混合型阳离子（MCX）固相萃取柱净化，洗脱液在45 ℃下氮吹至近干，含0.1%甲酸的乙腈水复溶后使用高效液相色谱-荧光测定，若检出则使用高效液相色谱-质谱/质谱确证，在提取黏性较大的半固体调味料时，若采用振摇提取，在提取液中加入陶瓷均质子可提高样品分散效果，使提取充分。

3.1.3 GB/T 19681—2005中苏丹红的测定

GB/T 19681—2005检测苏丹红Ⅰ～Ⅳ的原理是正己烷提取样品中的苏丹红染料，旋转蒸发浓缩，经氧化铝层析柱净化，5%丙酮正己烷洗脱，洗脱液经浓缩定容后使用高效液相色谱-二极管阵列检测器测定，实验前要提前处理中性氧化铝和填柱，填充氧化铝层析柱后要用标液验证每种苏丹红的回收率，判断中性氧化铝的活性，根据实际调整中性氧化铝的量。

3.1.4 SN/T 3536—2016中酸性橙Ⅱ号的测定

SN/T 3536—2013检测酸性橙Ⅱ号的原理是用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液2次提取样品中的酸性橙Ⅱ号，将提取液浓缩后，经氨基阴离子交换固相萃取柱净化，10%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液氮吹至干后水复溶，使用高效液相色谱-二极管阵列检测器测定，若用旋转蒸发浓缩方式，鸡心瓶内液体剩余20 mL时，会有气泡向上冲，易造成交叉污染而且浓缩时间长，因此浓缩时选择60 ℃水浴浓缩，浓缩时间明显减短、浓缩速度不会太快导致蒸干且不易交叉污染，浓缩后的待净化液直接用氨基阴离子交换固相萃取柱净化，易造成堵塞，而浓缩液离心后再净化可尽量避免此问题。

3.2 检测方法比较与适用性

3.2.1 罗丹明B

标准方法SN/T 2430—2010检测罗丹明B时提取简单，但是需要经过凝胶渗透色谱系统净化和旋转蒸发，耗时久，对乙酸乙酯-环己烷（1+1，V/V）用量大；BJS 201905检测罗丹明B的方法提取简单，净化速度快且净化效果好，回收率稳定在100%左右，相对标准偏差在10%以下。在段鹤君等[16]的研究中，方法1采用正己烷溶解调味油，0.5%冰乙酸酸化乙腈溶液2次超声提取，离心得到的提取液氮吹至近干，用乙腈-1%甲酸水（1+1，V/V）复溶，经MCX固相萃取柱净化，5%氨化甲醇洗脱，洗脱液氮吹至近干后用甲醇-水（50∶50，V/V）复溶后，用高效液相色谱荧光检测器进行测定，平均回收率为84.2%～94.0%，相对标准偏差为1.5%～2.9%；方法2采用20%丙酮正己烷2次超声提取调味油油，经中性氧化铝固相萃取柱净化，2%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液40 ℃氮吹至近干后甲醇复溶后，使用高效液相色谱荧光检测器进行测定，平均回收率为84.9%～92.6%，相对标准偏差为1.0%～2.1%。这两个方法都是采用固相萃取的方式净化，比用GPC净化节省时间和有机试剂，但是仅适用于调味油，因此对于辣椒油和花椒油可以采用此方法检测罗丹明B。

3.2.2 苏丹红

GB/T 19681—2005检测苏丹红染料时需要自己填充和验证层析柱，净化效果不稳定。冯寅洁等[17]研究了3种苏丹红专用固相萃取柱高效液相色谱仪检测食品中4种苏丹红染料的含量，发现Cleanert Sudan 固相萃取柱适用于浅色、低油脂食品的前处理，ProElut SDH固相萃取柱普遍适用于不同种类食品的前处理，CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱适用于辣椒粉以外的大部分食品的前处理，其中ProElut SDH 固相萃取柱的回收率为（83.7%±2.4%）～（90.5%±3.9%），还对常用于分析颜色深和高油脂的色谱柱的维护提出建议，如增加保护柱，分析后及时按乙腈-异丙醇-乙腈的顺序冲洗色谱柱，对可以反冲的色谱柱进行反冲等，该研究结合了实际应用，分析深入、详细且实用[17]。

3.2.3 酸性橙Ⅱ号

在用SN/T 3536—2013检测酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ号时，使用氨基阴离子交换固相萃取柱的回收率低于80%，参考了冯寅洁等[18]和刘颖等[19]的研究，得出使用混合弱阴离子（Cleanert PWAX）固相萃取柱净化能保证回收率和节约成本的结论。在蒋建荣等[20]用高效液相色谱-二极管阵列检测器半定性定量结合UHPLC-MS/MS确认阳性样品测定熟食制品中的酸性橙Ⅱ号的研究中，用70%乙腈水快速提取样品，使用高效液相色谱-二极管阵列检测器测定，对于阳性样品再用另一品牌的弱阴离子（Waters Oasis WAX）固相萃取柱净化，使用超高效液相色谱-质谱/质谱进行确证和定量，该方法利用了酸性橙Ⅱ号不得在食品中添加的规定，建立了快速检测的方法，提高了检测效率，同时确保了阳性样品的准确定性和定量，但是Waters Oasis WAX固相萃取柱价格比Cleanert PWAX高，但对回收率的提升不大，批量检测时采用Waters Oasis WAX固相萃取柱净化将增加检测的成本[18]。

4 结语

标准方法作为食品检测机构常用的检测方法，实际应用于食品中合成色素和违禁染料的检测时仍存在不足。部分标准检测方法前处理步骤复杂，消耗了大量的试剂和耗材，增加了检测所需的时间，在批量化检测时，成本高和效率低的缺点被放大，同时复杂的前处理还会导致回收率偏低；而标准检测方法对可测定物质的限定，导致同一种食品要用两个方法进行检测，说明了标准检测方法的局限性。随着研究的深入，不同学者的研究结果为完善标准方法提供了有力的参考依据。食品色泽关联食品安全，食品安全关乎人们的健康，基于食品中合成色素和违禁染料的滥用会损害人们的健康的事实，开发更准确、更高效、更广泛适用和更低成本的标准检测方法是批量化检测在未来发展的需求。因此，需进一步探索食品中合成色素和违禁染料的检测方法，减少人们对食品色泽的质疑，规范商家对合成色素的使用，营造更良好的食品安全坏境。