奇壬醇对骨质疏松症的治疗作用及机制研究进展

昌 震，李大同，杨小彬，孔令擘，孙 杨

(1.西安交通大学附属红会医院脊柱外科，陕西 西安 710054；2.汉中职业技术学院附属医院骨显微外科，陕西 汉中 723000)

现代研究表明，许多中草药具有放松关节、强化骨骼和肌肉的功能，并可用于治疗骨损伤的相关疾病，如骨质疏松症。天然植物或药物可以通过调节骨特异性基质蛋白、转录因子、细胞因子、信号通路、骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)与核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)受体活化因子受体配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系统(即OPG-RANKL系统)和激素类生物活性物质的表达来促进成骨细胞的增殖与分化。奇壬醇(Kirenol，Kir)是一种天然单体，在一些实验中显示其对破骨细胞的分化有着抑制作用，为骨质疏松症的治疗提供了新的前瞻性思路。现就奇壬醇对骨质疏松症的治疗作用及机制进行综述。

1 骨质疏松症概述

骨质疏松症是常见的骨科疾病，其特点是骨量减少与骨组织微结构的退化，极大地增加了骨折的风险。脊柱骨折不仅显著影响患者的生活质量，增加社会医疗负担，并且护理不当也会导致病死率的增加。事实上，由于寿命延长和人口老龄化加剧，骨质疏松性骨折的发病率在男性与女性人群中明显增高[1]。骨质疏松症主要分为原发性和继发性，包括绝经后由于雌激素水平下降导致的骨质疏松(即绝经后骨质疏松症)。其次是继发性疾病引起的骨质疏松症，这些疾病包括内分泌疾病(如皮质醇过多、甲状腺功能亢进)、肾脏疾病(如尿钙重吸收减少)、血液病(如多发性骨髓瘤和浸润骨的恶性肿瘤等)、自身免疫或风湿病(如炎症性肠病、类风湿性关节炎)、营养不良、吸收不良(乳糜泻等)等[2]。

骨质流失是一个缓慢的、无症状的过程，一般很难发现。因此，骨质疏松症通常在骨折后才被发现，在早期可以通过改变生活方式、加强营养、戒烟和戒酒来预防骨质疏松症的发生[3]。目前，骨质疏松症的一线治疗是通过药物搭配钙剂来补充日常骨骼代谢所需的成分，减轻或延缓骨质疏松的发生[4]。抗骨质疏松药物包括减少骨吸收药物(如双膦酸盐和地诺单抗)和加速骨形成药物或两者兼备的药物(如特立帕肽或阿帕罗品)，也有研究提出使用雌激素替代疗法来治疗骨质疏松症。这些药物与治疗方法可有效控制骨质疏松症，减少骨折的风险，但长时间使用带来的经济压力与不良反应是人们难以忽略的。尽管雌激素替代疗法在改善骨密度和减少绝经早期骨折发生率方面取得了积极的效果，但雌激素替代疗法的长期使用受到潜在并发症的限制，如乳腺癌、子宫出血和心血管等。双磷酸盐类药物的长期服用会带来颌骨坏死的风险。在口服双磷酸盐类药物治疗骨质疏松症的患者中，颌骨坏死的发生率似乎相对较低，而在接受大剂量静脉注射双磷酸盐的恶性肿瘤患者中则相对较高[5]。因此，最理想的治疗效果是通过强化骨形成来加速新骨的形成，纠正骨质疏松症所特有的小梁微结构不平衡，这种骨形成强化剂将为骨质疏松症的治疗提供一个新的选择[6]。

2 奇壬醇对骨质疏松症的治疗作用及机制

骨骼的形成和吸收平衡受多种细胞信号、激素和生长因子的调控，这些信号和因子主要受RANKL与OPG的调节[7]。RANKL在骨髓基质细胞(BMSC)和前骨细胞中，并在T细胞表面高度表达。当RANKL与NF-κB受体活化因子受体(RANK)结合时，破骨细胞的分化和功能就会增强[8]。除上述途径外，一些合成代谢信号途径也积极参与骨的形成，如骨形态发生蛋白(BMP)、细胞外因子(Wnt)和Runt相关转录因子2(Runx2)等[9]。Baron等[10]研究表明，Wnt途径的激活会增加骨强度和骨密度，而其失活会增加骨的脆性。Runx2/Cbfa1和成骨细胞特异性转录因子(OSX)对产生骨特异性基质蛋白[包括碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)等]的基因调节至关重要，并最终刺激骨结核的矿化[11]。

Kir是一种具有生物活性的二萜类中草药，具有抗风湿的特性。据报道，Kir具有抗炎、促进伤口愈合、免疫调节、抗关节炎和抗光老化的活性[12]。此外，它还能促进成骨细胞的分化[13]。一项骨折愈合实验研究显示，Kir的使用可以促进骨折愈合，并随着剂量的增加，促骨愈合的效果越好，这是由于Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)途径的早期激活与Runx2途径的持续活跃加速了骨形成。研究表明，Kir组大鼠在第10天的Wnt3a、β-catenin、T细胞因子(TCF)、脂蛋白相关蛋白5(LRP5)和 Runx2的表达增加量高于对照组，而在第10～21天对照组Wnt3a、β-catenin、Runx2和LRP5的表达增加量高于Kir组，这表明Wnt/β-catenin途径在骨折愈合的早期阶段更加活跃，Kir早期激活Wnt，随后在钙化过程中Wnt活性下降。除了对Wnt信号通路的影响外，Kir还增加了Runx2的水平。Kir可能通过促进成骨细胞的分化和增殖来促进骨愈合。此外，β-catenin水平的升高和Wnt途径的激活可能有助于Runx2水平的增加。并且，Kir也可以通过增加Wnt3a和β-catenin的水平来激活Wnt途径，加速成骨细胞的生成，这种作用随着剂量的增加而增强。因此，Kir通过对Runx2和Wnt信号通路的激活促进了骨质合成与骨愈合，减少了骨流失，这使得其可能可以控制以骨量流失为特征的疾病的进展[14]。

破骨细胞是一种大型的多核巨噬细胞，通过分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和蛋白酶来发挥骨骼的吸收功能[15]。破骨细胞的调控主要依靠RANKL-RANK通路、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白(AP-1)和 Ca2+-活化T细胞核因子1蛋白(NFATc1)信号通路的转导[16]。研究[17]表明，分别加入 50 μmol/L RANKL和 30 μmol/L 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激破骨细胞分化，再加入1.25 μmol/L Kir处理2 h后发现其对破骨细胞的形成具有抑制作用，且无细胞毒性；此外，1.25～10 μmol/L的 Kir以剂量依赖的方式明显减少了破骨细胞的骨吸收陷凹深度。单核早幼破骨细胞通过细胞融合的方式形成成熟破骨细胞，并具有骨吸收功能[18]。融合的多核细胞形成一个大的肌动蛋白环(即F-catin)，使其能够吸收骨质[19]。破骨细胞特异性基因[TRAP、破骨细胞相关受体(OSCAR)、组织蛋白酶K(CTSK)、破骨细胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)、人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和 β3-整合素)]表达能够诱导破骨细胞的形成和骨吸收。而研究[20]表明1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir能够抑制破骨细胞特异性基因的表达，包括 TRAP、OSCAR、OC-STAMP、CTSK和MMP-9。

RANK-RANKL信号通路激活了F-actin的形成，在5 μmol/L Kir的实验中减少了F-actin的大小和质量，干预和抑制破骨细胞的形成并削弱了骨吸收的过程。NF-κB信号通路在破骨细胞形成的早期阶段起着关键作用，NF-κB抑制因子α(I-κBα)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65作为信号通路成分更容易被检测到。1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir被证明可抑制I-κBα的降解和p65的磷酸化。5 μmol/L Kir对RANKL诱导的p65细胞质水平的抑制增加了p65的核转位。总之，Kir抑制了RANKL诱导的NF-κB信号通路激活。

除NF-κB外，在破骨细胞分化过程中，MAPK途径诱导破骨细胞的生成。RANKL刺激MAPK中的p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外调节蛋白激酶(ERPK)的磷酸化[21]。研究发现，5 μmol/L Kir能明显抑制p38和ERPK的磷酸化，但不抑制JNK的激活。激活蛋白-1(Ap-1)是破骨细胞分化过程中MAPKs下游的一个关键转录因子，而c-Fos是 AP-1复合物的一个重要亚单位。研究表明，用RANKL刺激骨髓基质细胞30 min 后，加入Kir可降低 c-Fos基因和蛋白质水平。此外，研究还发现，在 RANKL刺激 24 h后，c-Fos 核蛋白的表达也被 Kir抑制。

在破骨细胞中，NF-κB和MAPK/AP-1的激活会增强NFATc1的核位移，并触发破骨细胞相关基因的表达，包括 TRAP、OSCAR、CTSK和β3-整合素，最终诱导破骨细胞的分化成熟和骨吸收。NFATc1是破骨细胞核内细胞分化的主要转录因子，可被 Ca2+振荡上调。据报道，NFATc1基因敲除的小鼠会表现出严重的骨质疏松与骨量降低[22]。RANKL的刺激则可显著上调NFATc1基因和蛋白质的表达。此外，NFATc1还受钙离子内流的调节[23]。然而，窖蛋白(Cav-1)的缺乏会使得破骨细胞在分化过程中下调NFATc1和c-Fos的表达[24]，减少破骨细胞的生成。Cav-1还增加了Ca2+振荡的发生[25]。加入 1.25 μmol/L Kir处理后，NFATc1蛋白在细胞核中的表达明显减少。5 μmol/L Kir则可明显抑制RANKL刺激下的细胞Ca2+振荡，这与它对NFATc1核转位的抑制作用一致。有研究表明，Cav-1 mRNA和蛋白质表达都可以被5 μmol/L Kir所抑制。因此，Kir在破骨细胞分化中对 NFATc1的抑制可能是通过抑制Cav-1表达、限制Ca2+振荡来实现。

事实上，肿瘤坏死因子(TNF)在去卵巢(OVX)小鼠中骨流失作用的机制已经得到验证。TNF可以增强RANKL活性，诱导生成Th17细胞[26]。Th17细胞可以通过分泌白细胞介素(IL)-17A、RANKL、TNF、IL-1、IL-6以及低水平的γ干扰素(IFN-γ)来有效地诱导破骨细胞的生成，从而刺激骨吸收。IL-17A刺激包括成骨细胞在内的炎症细胞释放RANKL并通过上调RANKL活性来增加破骨细胞的活性[27]。在患有骨质疏松症的绝经后妇女的血清中已经发现，IL-17A水平明显升高。研究发现，雌激素通过雌激素受体α(ERα)的介导可以抑制CD4+T细胞分化为Th17细胞[28]，减少IL-17A的生成。此外，抑制IL-17A受体或使用抗IL-17A抗体都可能有限地减少OVX大鼠骨质疏松的发生率[29]。这些研究表明了IL-17A在介导骨质流失中的重要性。

在实验性自身免疫性脑脊髓炎(eEAE)的研究中发现，Kir可以有效地减少小鼠体内IFN-γ的产生，抑制产生IL-17A的CD4+T细胞的分化，在第25天收集的血清样本中，与盐水处理的对照小鼠相比，使用Kir的EAE小鼠血清中IFN-γ和IL-17A水平明显降低，这说明使用Kir的EAE小鼠体内的Th1/Th17等细胞明显减少。也有进一步研究[30]显示，Kir以浓度依赖的方式诱导CD4+T细胞发生凋亡。在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)实验中，可以观察到CD4+、CD25+、Foxp3+、 IL-4+、CD4+T细胞数量的增加和IFN-γ+、CD4+T细胞数量的减少。因此，Kir对TNF-α和IL-17A的产生均有抑制作用。在CIA的实验中也发现，对照组滑液中TNF-α、IL-17A和IL-6的水平增加，而在Kir或泼尼松龙组中的含量明显降低。也有研究发现，在溃疡性结肠炎小鼠中，Kir预处理能明显改善症状，减少结肠病变，使用Kir明显降低了小鼠淋巴细胞对IFN-γ、IL-17A、IL-6和TNF-α的分泌，增加了淋巴细胞的凋亡率，尤其是 CD4+T细胞。这些研究表明，Kir的作用范围很广，对多种疾病的相似信号通路都有稳定相似的作用。

Kir不仅对体外抑制破骨细胞生成和破骨细胞功能有积极作用，而且对OVX引起的骨质疏松症也有积极作用。研究发现，以2 mg/kg Kir与10 mg/kg Kir喂养OVX小鼠后，将股骨组织切片用HE和TRAP染色定量分析发现，小鼠BMD、骨小梁数目与骨小梁体积分数明显增加，而破骨细胞覆盖面面积与骨面比和侵蚀面面积/骨面比都明显减少，小鼠无不良反应；在使用实验小鼠的左股骨和胫骨骨髓基质细胞进行的进一步培养实验中，使用 2 mg/kg Kir和10 mg/kg Kir处理能显著降低破骨细胞的分化和骨吸收能力。该实验进一步证实了Kir既可抑制破骨细胞的形成，也可减轻因雌激素减低而引起的骨质疏松症[31]。

Cav-1是一种位于细胞膜上的重要结构蛋白，具有膜运输、胆固醇调节、内吞作用、细胞生长中信号转导和钙平衡的功能，被认为是控制破骨细胞分化的一个功能因子[32]。在OVX小鼠模型组中发现，Cav-1和 NFATc1 mRNA的表达升高，但经2 mg/kg Kir与10 mg/kg Kir处理后，其水平在体内明显降低，而且破骨细胞中的特异性基因(如 TRAP、ATP6v0d2和CTSK)明显减少，这表明Kir在体外和体内都能够抑制破骨细胞发生过程中Cav-1和NFATc1的表达。

3 结 语

骨质疏松症是一种多因素导致的骨质流失疾病，大大增加了骨折的风险。Kir作为具有生物活性的二萜类化合物，能够通过抑制多种信号传导途径抑制破骨细胞的活性，以减少骨破坏和吸收，同时通过积极的途径激活破骨细胞的生成以保持健康的骨量。Kir能抑制和屏蔽与各种骨质疏松症相关的细胞，进一步降低骨质疏松症的风险，预防OVX诱发的骨质疏松症。Kir为骨质疏松症等破骨细胞相关骨骼疾病的潜在治疗方法提供了有利的选择。