增殖性玻璃体视网膜疾病的细胞机制及其动物模型的研究进展

龚学春, 武志峰

(南京医科大学附属无锡第二人民医院 眼科, 江苏 无锡, 214000)

增殖性玻璃体视网膜疾病(PVR)是指孔源性视网膜脱离(RRD)及其术后眼内细胞在视网膜和玻璃体广泛增殖形成纤维增殖膜，随后纤维增殖膜收缩、牵拉视网膜的一种病变[1]。RRD患者并发PVR的概率为5%～10%，主要发生在RRD术后，是RRD手术失败最常见的原因之一[2]。合并PVR的RRD患者术后视力和视网膜解剖复位率都较差，其需要的社会医疗资源是无PVR的RRD患者的2倍[3]。手术是PVR目前最主要的治疗手段，然而手术无法预防和阻止眼内细胞的活化及过度增殖。本文对PVR形成过程中各种视网膜细胞作用机制及其动物模型的研究进展进行概述，为探索不同治疗方法提供依据。

1 视网膜细胞与PVR

PVR是一个复杂的过程，不仅涉及缺血性组织损伤，还涉及局部炎症以及细胞的增殖[4]。PVR形成的基本步骤是视网膜色素上皮(RPE)细胞和胶质细胞迁移到视网膜表面和玻璃体内，随后增殖形成纤维膜，收缩的纤维膜最终牵拉视网膜，导致视网膜脱离。在这个过程中，细胞增殖被认为是必不可少的[1]。有研究对PVR形成的纤维膜进行免疫组化，证明纤维膜主要由多种细胞和细胞外基质组成，其中细胞主要包括: RPE细胞、胶质细胞(主要是Müller细胞)、炎症细胞(主要为巨噬细胞)、成纤维/肌成纤维细胞等。在上述这些细胞中, RPE细胞在纤维膜细胞成分中所占比例最多，被认为在PVR发生发展中起到关键作用[5]。

1.1 RPE细胞与PVR

RPE细胞在生理条件下保持着细胞-细胞间接触，维持极化的上皮表型，是非增殖的，处于有丝分裂的静止状态。然而，当视网膜破裂或受到创伤时, RPE细胞间连接复合体破坏, RPE细胞暴露在由激活的免疫细胞产生的各种生长因子和炎症因子中被活化[6]。随后，活化的RPE细胞从Bruch膜分离，通过视网膜缺损迁移、增殖，最终参与形成纤维膜。在此过程中, RPE细胞经历了上皮间充质转化(EMT), 这是分离的极化细胞失去上皮特性的一种生物学过程，在PVR的发生发展中起着关键作用[7]。在EMT过程中, RPE细胞转分化为成纤维细胞及肌成纤维细胞，其主要特征是活力增强及增殖、抗凋亡和产生细胞外基质蛋白的能力增强，从而参与PVR纤维膜的形成，形成牵引力，是纤维膜牵引力构成的最主要成分。

目前对于PVR的研究主要集中于阻止RPE细胞的EMT, 研究[8-10]发现阻止RPE细胞的EMT进程往往能够延缓甚至阻止实验性PVR的进程。LYU Y L等[8]研究发现, PKA通路激活参与了PVR的发病过程，而PKA抑制剂H89可以在体外抑制RPE细胞的EMT进程，也能抑制PVR大鼠的病情进展。CUI L等[10]也发现微小RNA-194(miR-194)通过功能靶向ZEB1抑制RPE细胞EMT进程，从而抑制PVR大鼠的病情进展。CHEN X Y等[5]发现白细胞介素(IL)-6可以通过JAK1/STAT3通路诱导RPE细胞EMT，而阻断此途径可以阻止细胞EMT, 也可延缓小鼠PVR进程。MA X Q等[9]发现MettL3基因过表达可以通过Wnt/β-catenin通路减弱RPE细胞的EMT, 也可抑制大鼠的PVR进程。上述研究说明在PVR过程中RPE细胞起着关键性的作用。

1.2 Müller细胞与PVR

Müller细胞的表现更像是一把双刃剑，一方面，在RRD中，脱离的视网膜缺血会导致神经细胞死亡，而在损伤早期, Müller细胞的胶质增生对神经细胞产生保护作用，这种保护作用涉及许多不同的机制，包括缓冲升高的钾水平、抗氧化剂的释放、过量谷氨酸的摄取以及神经营养因子、生长因子等的产生[11-14]。另一方面，当视网膜脱离时, Müller细胞会被激活，并被诱导迁移、增殖, Müller细胞增殖在脱离后3～4 d达到高峰，并可能以较慢的速度持续数周至数月。在此期间, Müller细胞在视网膜表面，在视网膜下及视网膜内增殖、迁移，并且可以转化为具有成纤维/肌成纤维细胞表型的胶质细胞，参与PVR纤维膜的形成，是牵引力产生的组成成分之一[15-16]。随着时间进展，在中晚期PVR, 特别是在一些视网膜下和视网膜内PVR中, Müller细胞的肥大和胶质增生，逐渐占据了原本视网膜神经元的位置，导致了视网膜缩短和变形，加大了手术难度[4, 17-18]。

同时，Müller细胞分泌了大量的生长因子和炎症因子，如G-CSF、MCP-1、PDGF-BB、VEGF和TGFβ等[19], 这些因子既刺激RPE细胞和Müller细胞的迁移和增殖，也刺激这些细胞转分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，还能刺激肌成纤维细胞增强细胞外基质的表达，从而增强PVR纤维膜产生的牵引力[15]。但Müller细胞在PVR纤维膜牵引力的产生中更趋向于辅助的作用, PETERS M A等[20]发现，往玻璃体内注射不同数量的Müller细胞，在7 d时眼内形成的增殖膜纤维收缩反应的严重程度与注射的细胞数量相关，但在接下来的3周内几乎没有观察到这一过程的进展。相反，将Müller细胞和RPE以不同的比例注射，可以产生更强且是渐进性的纤维收缩反应。

1.3 成纤维细胞/肌成纤维细胞与PVR

成纤维细胞和肌成纤维细胞被认为是PVR纤维膜中主要的收缩细胞表型，并在PVR的收缩期发挥关键作用[7]。研究[16]表明, PVR纤维膜中的成纤维细胞和肌成纤维细胞大多来自RPE细胞和Müller细胞(主要是RPE细胞)。肌成纤维细胞可以看作是“被激活”的成纤维细胞，具有与平滑肌细胞相似的超微结构和生理特征，胞质内突出的肌成纤维细胞微丝束形成应力纤维，可以使细胞收缩[21]。而且肌成纤维细胞在各种生长因子、炎症因子的刺激下，可以迅速合成和积累过多的细胞外基质(主要包括胶原及纤连蛋白)[22]。肌成纤维细胞与细胞外基质之间形成特殊连接复合体，同时也与其他细胞间形成纤维连接，收缩并重塑细胞外基质，在组织中传递机械力，最终导致视网膜组织结构扭曲和随后的瘢痕形成[21-23]。

1.4 炎性细胞与PVR

在视网膜脱离发生后几小时内，血-视网膜屏障被破坏，中性粒细胞开始局部浸润，随后局部浸润的中性粒细胞开始释放一些生长因子及炎症因子[4], 如成纤维细胞生长因子(FGF)，进一步刺激了单核细胞的聚集及其向巨噬细胞的分化。分化的巨噬细胞开始吞噬受损的组织和细胞，并释放致炎因子，进而刺激成纤维/肌成纤维细胞的增殖、迁移[24]。MARTN F等[25]比较了合并PVR的RRD患者和单纯RRD患者玻璃体，最终证明，在RRD术后1个月内，合并PVR的RRD患者的玻璃体内巨噬细胞和成纤维细胞样细胞增多，即玻璃体中巨噬细胞的存在与PVR的高风险相关。由此对以上细胞参与PVR形成机制进行假设。首先，在RRD发生时，局部的缺血、炎症导致血-视网膜屏障破坏，炎性细胞局部浸润，释放炎症因子及生长因子，进一步促进炎性细胞聚集并向巨噬细胞分化。巨噬细胞吞噬损伤的细胞和组织，并释放致炎因子。与此同时，Müller细胞在损伤早期被激活，细胞肥大、增生，随着时间的推移，肥大、胶质增生的Müller细胞逐渐占据了原先视网膜神经细胞的位置，导致视网膜各层结构紊乱，视网膜皱缩、变形。同时，活化的Müller细胞也释放出大量的生长因子和炎症因子，导致玻璃体内含有大量成分复杂的细胞因子。RPE细胞、Müller细胞接触到了含有大量细胞因子的玻璃体液，在这些因子的作用下开始去极化、增殖、迁移并转分化为成纤维细胞(主要源于RPE细胞)，甚至进一步被激活为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞又迅速合成和积累大量的胶原及纤连蛋白，这些细胞外基质与肌成纤维细胞形成特殊复合体，收缩并传导机械力，形成对组织的牵拉，导致组织结构的破坏和扭曲。

玻切或外伤后PVR的形成更可能是因为手术或外伤加重了血视网膜屏障的破坏，从而加重了炎症等一系列反应，最终引起PVR。

2 PVR动物模型

由于PVR的主要病理变化是细胞过度增生，因而动物模型多以细胞增生模型为主，辅以其他手段。目前关于PVR模型的构建方法多种多样，主要分为以下几类: 玻璃体腔内注入各种细胞，包括RPE细胞、成纤维细胞、胶质细胞、巨噬细胞等; 玻璃体腔注入各种生长因子，如PDGF、TGF-β等; 玻璃体腔内注入血液或血液制品，如富含血小板的血浆(PRP); 手术、外伤诱导。成模过程中，往往采用玻璃体腔内注入细胞，加上另外1种或2种方法相结合。此外，还有如在玻璃体腔内注入分散酶等方法。以下介绍几种主要实验动物的PVR模型的发展。

2.1 兔

兔因其性格温顺、眼球较大而晶状体相对较小以及便于操作观察等优点，是目前最常用于PVR模型构建的动物。1975年的研究发现，往兔玻璃体腔内注入自体真皮成纤维细胞可以引起纤维增生并牵拉视网膜 。但该研究注入细胞为自体真皮成纤维细胞，该细胞与PVR形成过程无关。相关研究往兔玻璃体腔内注入了RPE细胞，发现产生的纤维膜与注入成纤维细胞模型的相似，之后将同种成纤维细胞注入了进行玻璃体切割术后的兔子玻璃体腔内，造模成功率达到了100%。但在兔眼内行玻切手术较为复杂，相关研究对上述模型进行了改良，提出用气体压缩形成类似玻璃体切除的效果，随后注入成纤维细胞，也可形成类似PVR的效果。之后有研究[26]尝试在兔玻璃体腔内注入活化巨噬细胞，也形成了纤维膜增殖并牵拉视网膜的效果。

随着对PVR认识的逐步加深，依次有人提出了在兔玻璃体腔内注射人类RPE细胞[27], 玻璃体腔内注射分散酶(dispase酶)[28]、气体压缩和注射RPE细胞[29]、注射RPE细胞和CTGF[30]及注射RPE细胞和PDGF[31]等方法，这些方法都取得成功。目前，比较常用的方法是兔玻璃体腔内注射RPE细胞和PDGF[32-33]，该方法具有操作简单、成功率高、成模时间短等优点。然而上述方法的PVR模型形成迅速，与临床PVR的长期过程也存在一定的差异。HIROSE F等[34]将bFGF和IFNβ制成一种明胶微球缓释系统，成功设计了一种长期、慢性、稳定的PVR动物模型。MOON S W等[35]利用基质胶及VEGF视网膜下注射也形成了一种慢性PVR模型。随着对PVR认识的加深，动物模型也在不断发展，也越来越接近人PVR的发展过程。

2.2 大鼠和小鼠

鼠类具有管理方便、易于饲养等优点，然而鼠类眼球小、晶状体呈球形及操作不方便且不利于观察，故鼠类模型相较于兔模型较少。

目前的大鼠模型有以下几种: 视网膜下注射分散酶(dispase酶)[36]; 玻璃体腔注射RPE细胞和TGF-β1[37]; 玻璃体腔内注射刀豆蛋白A或分散酶(dispase酶)[38-39]; 玻璃体内注射巨噬细胞[40]; 玻璃体腔内先注射透明质酸酶，液化玻璃体后，再注射RPE细胞及PRP[8, 10], 此模型也是目前最常用的大鼠模型。

小鼠既往最常用的PVR模型为在玻璃体腔内注入dispase酶，该方法最早在2002年建立，并一直沿用至今[41]。然而该方法视网膜的完整性会受到严重影响，dispase酶会破坏视网膜结构，产生明显的出血，并不能完全模仿人类PVR的发病进展。HEFFER A 等[42]在2020年仿照兔PVR模型成功构建了一种新的小鼠PVR模型: 先在玻璃体腔内注射气体促进玻璃体后脱离，随后注入RPE细胞，该模型也更加接近人类PVR的发病进展[43]。然而小鼠眼球小，该方法操作难度较大。

2.3 其他动物

猪、除人以外的灵长类动物的模型相对较少。其中，猪因其眼球大小与人类相似，手术操作方便等优点而备受某些研究者的青睐，然而饲养场地限制、价格高等因素还是制约了猪PVR模型的使用。目前，主要的猪PVR模型于2012年由UMAZUME K等[44]构建: 首先对猪眼行玻璃体切割手术，形成玻璃体后脱离，随后在该眼的视网膜下注射平衡盐溶液形成视网膜脱离，最后向玻璃体腔注入RPE细胞成模，目前使用最多的猪PVR模型也是这种[45]。WONG C W等[46]在比较内源性和外源性RPE细胞形成的PVR模型时，对此模型做了一些改良，在操作最后向玻璃体腔内注入了RPE细胞和PRP, 而非单纯注入RPE细胞。

3 总结与展望

PVR是RRD及其术后严重的并发症，严重影响手术的成功率和患者视力。PVR的发病机制主要涉及各种视网膜细胞的增殖，目前手术是PVR治疗的主要方法，相关研究仍在通过动物实验模型不断寻找能够预防甚至阻止RRD术后PVR发展的辅助治疗方法，将来的治疗手段很可能为联合使用药物抑制眼内细胞增殖。本文有助于深刻认识PVR, 并为探究PVR治疗方法提供依据。