凝溶胶蛋白对乳腺癌MCF-7细胞的影响及其机制

李福志 张红 王亚帝

(1锦州医科大学，辽宁 锦州 121000；2锦州医科大学附属第三医院肿瘤外科)

乳腺癌位居全球女性癌症的首位，也是中国女性第一高发的恶性肿瘤，其发病率逐年升高，严重威胁女性的生命健康〔1,2〕。近年来，虽然随着检测技术和治疗手段的不断提高，乳腺癌患者5年生存率已近90%〔3〕，但由于很多乳腺癌患者早期即出现淋巴结转移，除手术剔除癌变的淋巴结外，目前尚无特殊的治疗方法，故导致许多患者预后不良。因此，尽早发现乳腺癌、阻止乳腺癌早期淋巴结转移，对乳腺癌患者的预后具有重要的临床意义。

凝溶胶蛋白(GSN)是GSNs超家族中一个重要的肌动蛋白结合蛋白(ABP)，是细胞结构和代谢的多功能调节剂，其参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等多个步骤〔4〕。有研究显示，GSN可通过抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)的活化和上调金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)-3的表达，抑制乳腺癌细胞 MCF7/Her2 增殖、迁移及侵袭〔5〕；通过抑制PKR-p38信号通路，抑制胃癌细胞的迁移〔6〕。

为进一步阐明GSN在乳腺癌的发生、发展中的作用及可能的作用机制，从而为临床上早期发现乳腺癌、阻止其淋巴结的转移提供参考，本文观察GSN在乳腺浸润性导管癌组织的表达情况并探讨其过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭影响及其机制。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2018年1～12月锦州医科大学附属第三医院和锦州医科大学附属第一医院经临床病理确诊的40例女性乳腺浸润性导管癌患者的癌组织标本，TNM 分期〔7〕：T1N1-3期20例、T2-3N0期20例；平均年龄(54.73±8.63)岁。同时收集20例乳腺腺瘤患者瘤旁正常组织标本作为对照。所有患者：①为原发乳腺癌，且未合并其他肿瘤；②术前未行放疗、化疗和免疫治疗；③无远处转移。

1.2细胞、质粒 MCF-7细胞(BNCC315787)购自北京北纳创联生物技术研究院，GSN过表达载体GSN-pcDNA3.1由江西中洪博元生物技术有限公司合成和提供。

1.3主要试剂和仪器 兔抗人GSN 单克隆抗体(货号：11644-2-AP,稀释比：1/1 000) 购自美国Proteintech Group公司，兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K，ab151549,1/1 000)、兔抗人蛋白激酶B(AKT，ab8805,1/500)均购自沃卡威(北京)生物技术公司，兔抗人p-AKT(AF0016,1/1 000) 购自美国Affinity Biosciences公司，转染试剂Lipofectamine3000购自美国英杰生命技术有限公司，无血清培养基(Opti-MEM)、CCK8试剂盒均购自江苏凯基生物技术股份公司，免疫组化检测试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Transwell小室购自美国康宁公司，超纯RNA提取试剂盒(CW0581M)、BCA试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有好公司,HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；实时荧光定量PCR系统(CFX ConnectTM实时)、超高灵敏度化学发光成像系统(Chemi DocTMXRS+)均购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4GSN表达水平的检测 采用免疫组化法。按照免疫组化试剂盒说明书进行操作：常规石蜡包埋收集的T1N1-3期T2-3N0期乳腺癌组织和正常组织标本，按厚约3 μm连续切片，脱蜡、脱水后，用pH 6.0的柠檬酸钠作为抗原修复液，置120℃高压中修复3 min,加入新配制的3%过氧化氢(H2O2)水封闭孵育30 min；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3～5 min,加入兔抗人GSN单克隆抗体 (1∶200稀释)，4℃孵育过夜；取出切片室温静置45 min，PBS浸洗后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶100稀释)，37℃孵育30 min，PBS充分洗涤；常规二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染、脱水、透明、封片、镜检。

1.5GSN过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭影响的检测

1.5.1细胞培养和转染 将浓度为5 000个细胞/ml的MCF-7细胞接种至100 μl含10%胎牛血清(FBS)和1% 青霉素链霉素混合液的MEM完全培养基的96孔培养版中，置37℃、5% CO2培养箱中进行培养；当细胞融合度达90%以上时，弃去培养液，PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min后，加入100 μl含10% FBS的MEM完全培养基进行充分吹打，将吹打下来的细胞用吸管吸取至10 ml离心管中，离心、弃去上清，加入MEM完全培养基，吸出细胞液、接种至100 ml培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。当细胞密度达70%时，将细胞培养基更换为不含血清的培养基，并按lipofectamine P3000说明书进行转染：取2支灭菌EP管，每管加入上述培养的MCF-7细胞和125 μl Opti-MEM后，其中一管加入5 μl转染试剂 lipofectamine3000(空载组)、另一管加入2.5 μg GSN-pcDNA3.1和5 μl lipofectamine P3000(GSN过表达组)，同时设细胞对照(空白组)，混匀后置室温孵育15 min；用移液管将EP管中液体滴加至6孔培养板中的对应孔内，置37℃、5%CO2孵箱中转染4 h后，向6孔板中加入1 ml血清含量为20%的完全培养基，置37℃、5%CO2孵箱中继续转染48 h，采用RT-qPCR和Western印迹检测MCF-7细胞转染效率。

1.5.2MCF-7细胞转染效率的检测

1.5.2.1实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测 收集转染48 h后细胞，加入Trizon 裂解液，用移液枪吹打，使贴壁细胞悬浮、并与裂解液充分接触；收集细胞悬液，按照超纯RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，采用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度和纯度(A260/A280)。按照HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒说明书将提取的总RNA逆转录合成cDNA，以合成的cDNA为模板，采用荧光PCR仪进行荧光定量PCR，扩增体系：RNase Free ddH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl，总体系为25 μl；扩增条件：预变性 95℃预变性10 min，95℃变性10 s，58℃退火30 s，延伸72℃延伸30 s,共40个循环。GSN上游引物：5′-GATTGGACGTTTTGTGA-TCGAAG-3′，下游5′-TCCGTCTCGATGTACCGCTT-3′；以GAPDH作为内参：GAPDH上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。根据2-△△Ct法计算GSN的相对表达量。

1.5.2.2Western印迹检测 取转染48 h后细胞，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离2 h后，电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用3%的脱脂牛奶常温封闭1 h；加入兔抗人GSN单克隆抗体(1∶1 000稀释)，常温过夜后，PBST充分洗涤，加入HRP标记的山羊抗兔IgG (1∶2 000释)，常温作用2 h；PBST充分洗涤后，加入TMT底物,避光显色，用蒸馏水终止显色。

1.5.3GSN过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖影响的检测 采用CCK8检测法。收集转染48 h后细胞，弃去培养液，PBS洗2次，加入0.25% 胰蛋白酶消化3 min后，加入含10%FBS的MEM完全培养基，吹打细胞，用移液管将细胞液移至10 ml离心管中，离心、弃去上清。按CCK8试剂盒说明书进行操作：取100 μl细胞悬液接种至96孔培养板中，5×103个细胞/孔，置37℃、5% CO2培养箱中培养，分别于细胞培养24、48、72 h时，加入CCK8试剂，10 μl/孔，再于培养箱中继续培养2 h后，置酶标仪波长405 nm处读取各孔吸光度值(A)。

1.5.4GSN过表达对乳腺癌MCF-7细胞侵袭影响的检测 采用Transwell侵袭试验。收集转染48 h后细胞，弃去培养液，PBS洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min；加入含10%FBS的完全培养基，用吸管吹打细胞，将吹打下来的细胞吸至10 ml离心管中，离心，弃上清，用无血清培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为5×104个细胞/ml后，接种在Transwell上室，100 μl/孔，并使上室每孔细胞与无血清培养基总体积约300 μl；在Transwell下室加入500 μl含10% FBS完全培养基，置37℃、5%CO2孵箱中孵育48 h；取出小室，弃去培养基，PBS漂洗5 min后，用95%乙醇固定10 min，0.1%结晶紫静置染色1 h，PBS洗涤，用棉签擦去上室内细胞，将小室倒置在载玻片上于镜下进行拍照后，随机取5个视野，计数每个视野MCF-7细胞数，取平均值。

1.6GSN过表达对MCF-7细胞中PI3K-AKT信号通路影响的检测 采用Western印迹法。取转染48 h后细胞，加入100 μl裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，按BCA试剂盒说明书测定上清中蛋白浓度。取7 μl蛋白样品，常规SDS-PAGE分离2 h后，电转至PVDF膜上，用3%的脱脂牛奶封闭1 h；分别加入兔抗人GSN单克隆抗体(1∶1 000稀释)、兔抗人PI3K(1∶1 000稀释)、兔抗人AKT(1∶500稀释)和兔抗人p-AKT(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜；TBST洗涤后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶100稀释)，室温孵育2 h。充分洗膜后，在膜上滴加电化学发光(ECL)试剂盒曝光液，于凝胶成像系统中曝光，以GAPDH为内参照，用ImageJ软件分析各抗体蛋白的相对表达量。

1.7统计学方法 采用GraphPad Prism7软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1GSN的表达水平 与乳腺正常组织(GSN在乳腺正常组织细胞胞质中呈棕黄色高表达，32.246±2.948)相比，GSN在T1N1-3期和T2-3N0期乳腺癌组织明显低于乳腺正常组织(8.542±5.267、18.146±7.393，P<0.05)，且T1N1-3期乳腺癌组织中GSN含量最低，见图1。

图1 GSN在乳腺正常组织及T1N1-3期、T2-3N0期乳腺癌组织中表达(SP，×200)

2.2GSN过表达转染效率 与空白组相比，GSN过表达组GSN mRNA和蛋白的相对表达水平显著上调(P<0.05)，表明转染成功，见图2、表1。

1～3：空白组，空载组，GSN过表达组，图4同

表1 RT-qPCR与Western印迹验证GSN过表达转染效率

2.3GSN过表达对MCF-7细胞增殖的影响 与空白组相比，GSN过表达24 h和48 h时显著抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05)；但培养72 h时，GSN过表达组对MCF-7细胞增殖的影响与空白组对比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 GSN过表达在各时间点对MCF-7细胞增殖的影响

2.4GSN过表达对MCF-7细胞侵袭的影响 与空白和空载组相比，GSN过表达组显著抑制MCF-7细胞的侵袭〔(865.00±15.716)个、(853.33±24.906)个、(735.67±14.844)个；P<0.05〕，见图3。

图3 GSN过表达对MCF-7细胞侵袭的影响(结晶紫染色，×100)

2.5GSN过表达对MCF-7细胞中PI3K-AKT信号通路的影响 与空白组和空载组相比，GSN过表达组显著下调PI3K-AKT信号通路中相关蛋白PI3K和p-AKT蛋白的表达水平(P<0.05)，表明GSN过表达可抑制PI3K-AKT信号通路活化，见图4、表3。

图4 GSN过表达对MCF-7细胞中PI3K-AKT信号通路的影响

表3 Western印迹检测PI3K-AKT通路相关蛋白表达

3 讨 论

作为胞质内一种重要的肌动蛋白(actin)结合蛋白，GSN与炎症、肿瘤等多种疾病的病理过程密切相关〔8〕。在体外，GSN在乳腺癌〔5〕和胃癌〔9〕、结肠癌〔10〕、肾癌〔11〕、卵巢癌〔12〕等多种肿瘤中表达水平均降低，具有明显的肿瘤抑制作用，在肿瘤的发生过程中起负调节作用，被认为是1种候选的抑癌基因。

本研究结果与以往的研究结果一致，推测GSN可能在乳腺浸润性导管癌的发生和淋巴转移中起了抑制作用。虽然目前对GSN 在肿瘤细胞中低表达的机制尚不很清楚，但Haga等〔13〕研究发现，组蛋白脱乙酰基作用和 GSN 基因启动子核心区域形成的茎环结构是GSN 基因启动子沉默的原因；Kim等〔14〕通过对胃癌的研究，认为GSN在肿瘤中的低表达与癌组织中组蛋白去乙酰化酶 1 的高表达密切相关，是由于基因外的机制调控所致；Ni等〔15〕在对胰腺癌研究显示，泛素-蛋白酶体途径参与了GSN 的降解，致 GSN 在胰腺癌中呈低表达，推测蛋白翻译后修饰是 GSN 在肿瘤中低表达的一个重要因素。

Zhu等〔11〕在体外观察到，GSN的过表达在抑制786-0透明细胞肾细胞癌细(ccRCC)的黏附能力的同时，也抑制了该细胞的增殖和侵袭；也有研究显示，GSN过表达降低了结肠癌细胞的增殖和侵袭〔10〕；GSN过表达可抑制自然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭〔16〕。Chen等〔17〕认为，GSN对MCF-7细胞增殖的抑制机制可能是GSN过表达发生在MCF-7细胞G0/G1期的细胞周期停滞，中止细胞周期向DNA合成(S期)的进展所致；赵元茵等〔5〕认为，GSN过表达对MCF-7细胞侵袭的抑制机制可能是由于雌激素介导的ERK活化被GSN抑制，亦或GSN上调了TIMP-3导致的，因为ERK是细胞增殖的重要刺激因素，而TIMP-3是肿瘤细胞侵袭关键抑制因子。也有学者认为，GSN 抑制肿瘤的作用机制可能与其调节 actin微丝的长度、抑制磷脂信号传递〔18〕、参与调节细胞周期〔19〕、调节细胞凋亡〔20〕等相关；通过降低基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的水平抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力，MMP2和MMP9被认为是肿瘤细胞迁移的关键因素，MMP2和MMP9被GSN刺激后呈剂量依赖性降低〔21〕。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，作为细胞存活的重要调节剂，被认为是肿瘤发生的关键因素〔22〕；AKT是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在多种细胞的代谢、生长、增殖、存活、转录及蛋白质合成等方面发挥重要作用，因此PI3K/AKT通路是同时具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞内信号通路〔23〕，可参与调节多种细胞的增殖、凋亡、存活、生长等生理功能，并已通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖靶向许多癌症〔24〕。有研究发现，GSN-PI3K-AKT信号传导可能参与调节恶性肿瘤迁移和侵袭的上皮-间质转化(EMT)〔11〕，GSN 通过抑制 PI3K/AKT信号通路，减少EMT诱导细胞骨架重塑，从而抑制肿瘤的转移〔25〕。

本研究结果与Guo等〔16〕的研究结果一致，GSN过表达可显著下调了MCF-7细胞PI3K-AKT信号通路中PI3K和p-AKT蛋白的表达水平，表明GSN过表达可抑制PI3K/Akt信号通过，GSN过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路所致，可作为抑制乳腺浸润性导管癌早期转移的一个治疗靶点。