紧密连接蛋白Claudin-3的研究进展*

李明航，刘海林，刁俊玲，周春巧 综述，王 松 审校

(重庆两江新区第一人民医院药剂科，重庆 401147)

紧密连接是细胞膜相邻之间一起构成的一道物理屏障。该屏障和细胞增殖、分化调控，以及肿瘤细胞在体内的迁移有关[1]。紧密连接蛋白由细胞质附着蛋白、跨膜蛋白和细胞骨架蛋白共同组成。跨膜蛋白又包括以下3种完整膜蛋白：连接黏附分子(JAM)、咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudin)。目前认为，其主要作用的是Occludin和Claudin，尤其以Claudin的作用最为重要，这是形成紧密连接功能的主要蛋白。Claudin中的Claudin-3在维持细胞间物理屏障功能和参与分子细胞间传递方面发挥着重要作用。本文对Claudin-3目前的相关研究进展进行综述，以便临床进一步的了解Claudin-3在相关疾病检测、诊断、治疗及预后判断方面的重要性。

1 紧密连接蛋白Claudin-3概况

Claudin是一类相对分子质量在17～27 kDa的跨膜紧密连接蛋白，目前已发现有近30个家族成员，其主要作用是维持细胞间的物理屏障功能及细胞极性[2-3]。紧密连接蛋白如果出现异常表达，则会使细胞间的屏障结构遭到破坏，使细胞间的黏附力下降，导致细胞极性丧失，从而致使肿瘤发生[4-6]。在紧密连接的结构中，每种Claudin蛋白都具有独一无二的自身细胞旁离子选择性[7]，其在人体内的各种组织、器官的离子交换选择性完全不同。在Claudin家族蛋白成员中，不同的蛋白会以多种排列组合方式参与构成紧密连接的物理屏障，提高紧密连接的生物功能多样性，为人体内不同组织类型的物理屏障功能多样性提供了分子学的理论依据。只要Claudin蛋白发生细微的改变，就会影响到整个紧密连接物理屏障的结构和功能。这种细微的改变可以是基因突变，也可以是数量改变。一旦紧密连接物理屏障的功能遭到不可逆的破坏，上皮细胞之前存在的极性即遭到不同程度的改变，导致不同液体空间的脂质和蛋白发生自由扩散，2个不同内环境之间的渗透屏障也会遭到破坏，最终直接导致组织的生物学特性发生改变，严重时甚至会使细胞外环境潜在的有害物质或病原体进入机体。Claudin-3是构成紧密连接的一种特异性跨膜蛋白，在不同类型的组织中，其表达也具有较大差异，这归结于细胞内分子信号的精确传递和其组织特异性。

2 Claudin-3的生物学特性

Claudin-3具有3种相互关联的生物学特性：屏障功能、栅栏功能和信号转导功能。紧密连接由分支状封闭索网络组成，每条封闭索独立于其他封闭索作用。紧密连接防止离子通过的能力随封闭索的数目呈指数级增长。每条封闭索由一列嵌入2个原生质膜的跨膜蛋白构成，蛋白的胞外结构域使其彼此间一个个直接相联。尽管还有其他蛋白存在，2种主要类型的蛋白是密封蛋白和Claudin。它们与位于细胞膜内侧不同的外周膜蛋白相联，后者则把封闭索锚定到肌动蛋白细胞骨架。因此，紧密连接连起了相邻细胞的细胞骨架。紧密连接蛋白Claudin-3主要通过体内蛋白激酶的途径，对细胞与细胞连接处的选择性渗透进行调节。其中,蛋白激酶A和蛋白激酶C作用于Claudin-3蛋白上特定的氨基酸靶点，一般以丝氨酸和苏氨酸为主要氨基酸。Claudin-3蛋白发生磷酸化后，其维持紧密连接的屏障及栅栏功能开始下降，主要表现为外周氯化物的渗透增加，血脑屏障被破坏。此外，Claudin-3蛋白的信号转导功能也开始下降，这可能与信号物质及其蛋白结合物在细胞间的转移和扩散有关。

3 Claudin-3与疾病

Claudin-3是构成内皮细胞紧密连接的主要蛋白，当其表达发生异常时可导致内皮细胞间结构遭到损坏。研究发现，Claudin-3与多种疾病(如脑缺血、胆固醇结石、肿瘤等)密切相关。然而，Claudin-3与疾病的发生、发展及转归具有复杂关系，且在这些疾病状态下Claudin-3表达的调控机制仍需更深入的研究。

3.1Claudin-3与脑缺血 脑缺血是目前中老年人群中常见的脑血管疾病之一。有研究表明，血脑屏障结构的破坏是导致早期脑缺血的主要病理学基础。血脑屏障结构主要由周细胞和内皮细胞构成，星形细胞的足突包裹着毛细血管外周。内皮细胞之间的紧密连接结构是构成血脑屏障的最重要部分。在脑微血管内皮系统中，Claudin-3的表达十分丰富。Claudin-3是构成内皮细胞紧密连接的主要蛋白，当其表达发生异常时可导致内皮细胞间结构遭到损坏，血脑屏障通透性也随之变化。可能原因是，磷酸化的Claudins-3会干扰紧密连接的形成[8]。HARTWIG等[9]研究发现，在人类自身的免疫性脑脊髓炎和成胶质胞瘤中，小静脉上因为包绕炎性物质，从而使紧密连接因失去Claudin-3而导致免疫着色。然而，其他紧密连接蛋白的结构和功能未发生改变，由此可以推断Claudin-3在体内血脑屏障紧密连接的稳定性方面起重要作用。Claudin-3与血脑屏障的结构、功能密切相关，提示可以通过人为改变紧密连接蛋白Claudin-3的表达来改变血脑屏障的通透性，从而改变治疗药物在脑组织的有效溶度，这为今后治疗中枢神经系统疾病开辟了新路径，提供了新的药物作用靶点。

3.2Claudin-3与胆固醇结石 胆固醇结石是一种主要常见于成人的疾病，发病率随着年龄的增长而增高。胆固醇结石常见病因包括肥胖、妊娠、糖尿病等。通常认造成胆固醇结石的主要病理学基础是胆固醇饱和度升高，所以临床上胆固醇结石的治疗主要针对高脂、年龄增长相关的脂质代谢紊乱等。实际上，构成胆固醇结石的主要核心是钙和对钙敏感的碳酸根、磷酸根、硬脂酸根等阴离子，但是尚不清楚其在胆固醇结石形成中的作用机制。由于细胞间的紧密连接蛋白在调控水和某些阴离子经过旁细胞途径转运中发挥着重要的屏障作用，张嘉昕等[10]将研究重点放在了小鼠肝脏中高表达的紧密连接蛋白Claudin-3。其发现在敲除了Claudin-3基因的小鼠肝脏中，旁细胞的屏障功能受到损坏，细胞间水、金属离子、磷酸根离子的转运增加，导致胆汁中离子代谢出现失衡现象。正常饮食条件下，在敲除了Claudin-3基因的小鼠中可以观察到深褐色沉淀物，沉淀物的主要成分是磷酸钙。但是并未在敲除了Claudin-2基因的小鼠中发现该物质。进一步在高脂饮食条件下，如果将小鼠的Claudin-3基因敲除，可以加速形成以磷酸钙核心的浅褐色胆固醇结石，这为“高脂饮食条件下促进胆固醇结石形成”的理论提供了新的实验依据。此外，在小鼠肝脏中，Claudin-3的表达会随年龄的增加而降低，这有助于更好地解释胆固醇结石的发病率与年龄的关系。研究揭示了人体内胆固醇结石形成的新机制：紧密连接蛋白Claudin-3受损缺失，导致旁细胞屏障功能降低，增加了离子经肝胆管上皮的旁细胞转运通路，最终形成以磷酸钙为主的胆固醇结石。

3.3Claudin-3与前列腺癌 研究发现，在前列腺癌、结直肠癌和鼻咽癌等均有Claudins蛋白的异常表达，且Claudin-3在不同癌细胞中的表达量也不同。紧密连接蛋白的异常表达导致上皮细胞渗透屏障遭到破坏，细胞极性丧失，细胞间的黏附力下降，最终导致肿瘤细胞的扩散和转移。在某些恶性肿瘤发生的时候[11]，Claudin蛋白总体表达水平明显下降，这被认为是细胞间黏附性丢失的机制和肿瘤细胞发生及转移的重要步骤。然而，临床在多数肿瘤组织中发现，Claudin表达水平较正常细胞组织明显升高[12]，这意味着Claudin表达上调在肿瘤的发生、发展中也起到了促进作用。Claudin-3跨膜蛋白在细胞间的传输和转运中起重要作用，而细胞黏附功能的基础又是紧密连接，这与肿瘤的发生、发展密切相关[13]。毕罡等[14]研究发现，相对于前列腺增生组织，Claudin-3蛋白在前列腺癌组织中的表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。AGARWAL等[15]利用Northen印迹发现，与周围正常组织比较，人类前列腺癌组织上皮细胞中的Claudin-3基因转录信使RNA水平显著增高；采用免疫组织化学方法发现，骨转移灶中的Claudin-3蛋白表达水平也出现增高现象。2种差异性的表达使得Claudin-3蛋白有可能成为诊断前列腺癌的候选癌标。Claudin-3也是产气荚膜杆菌肠毒素(CPE)的受体，可以通过CPE对高表达Claudin-3蛋白的肿瘤组织产生特异性细胞溶解作用，这可以为探索Claudin-3表达上调的肿瘤治疗新技术提供理论基础和实验依据。李家兵等[16]通过检测前列腺癌和良性前列腺增生组织中的Claudin-3信使RNA表达水平平，发现Claudin-3信使RNA在前列腺癌组织和良性前列腺增生组织中的表达水平有显著性差异，其在前列腺癌组织中的表达水平高，而在良性前列腺增生组织中的表达水平低，推测Claudin-3可能成为诊断前列腺癌的候选癌标，也可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点。

3.4Claudin-3与结直肠癌 目前，我国的结直肠癌发病率位居恶性肿瘤疾病第4位，且仍有上升趋势[17]。有研究证实，上皮间质转化在癌症的发生、进展中起重要作用，其主要表现是紧密连接结构在肿瘤边缘细胞处遭到破坏。紧密连接是相邻细胞膜与细胞膜共同构成的物理屏障，与细胞增殖、分化调控及肿瘤细胞转移有关[1]。陈宗池等[18]发现，结直肠癌组中的Claudin-3表达水平明显高于正常结直肠组及结直肠腺瘤组，结直肠腺瘤组的Claudin-3表达水平也显著高于正常结直肠组。YASUNORI等[19]通过体外细胞研究发现，Claudin-3在结直肠癌细胞中呈高表达状态，提示Claudin-3表达上调可能参与恶性肿瘤的发生。当Claudin蛋白发生异常表达时，上皮细胞对细胞旁通路的通透性发生异常，促进癌症的发生[20]。YAXI等[21]通过小鼠动物模型对结直肠癌组织中Claudin-3的表达变化进行了体内和体外研究。结果表明，通过激活SCF/c-kit/JNK/AP-1细胞信号转导通路，可使Claudin-3在结直肠癌组织中的水平升高，结直肠癌的发生可能与Claudin-3的异常表达有关，提示Claudin-3有可能成为早期诊断结直肠癌的检测指标之一。癌细胞转移的重要步骤是对内皮细胞和间皮细胞的侵袭[22]，而肿瘤转移涉及到一系列级联反应的过程，只有完成这些级联反应，癌细胞才能转移到远处。而要完成上述转移级联反应，就必须破坏紧密连接的物理屏障作用，导致细胞极性和细胞间的黏附性丢失。Claudin-3在细胞黏附功能的丢失、转移过程起重要作用。因此，破坏Claudin-3维持紧密连接的完整性是完成转移级联反应发生的关键步骤。但是，由于样本量有限及缺少相关机制研究，Claudin-3能否作为结直肠癌的治疗靶点有待深入基础和临床研究。

3.5Claudin-3与鼻咽癌 鼻咽癌是一个多阶段变异累积、多基因参与形成的病理过程。寻找鼻咽癌的分子标志物将有利于个体化治疗方案选择及预后评估。研究表明，Claudin蛋白在恶性肿瘤发展的一系列病理生理过程中发挥作用[23]。Claudin-3也是如此，其在不同的肿瘤组织中呈现不同的表达水平，也发挥着不一样的作用。陈茹等[24]发现，Claudin-3在鼻咽癌组织中的表达率要高于鼻咽癌旁组织，但是两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。然而，在病理分期更高的鼻咽癌组织，Claudin-3的表达率更高，多项研究显示了鼻咽癌的临床分期与血清EB病毒抗体的滴度有关[25-26]，推断Claudin-3的表达升高与鼻咽癌临床分期有关，Claudin-3可能在鼻咽癌的病程发展中起一定作用。近年来，肿瘤发生、发展过程中的细胞间连接功能异常逐渐受到重视，干预该过程的关键蛋白从而抑制肿瘤细胞的扩散和转移已成为肿瘤研究领域的新热点。Claudin-3的异常表达与鼻咽癌的发生、发展密切相关，有望成为治疗鼻咽癌的新靶点，可对其开展深入研究。

4 小结与展望

紧密连接蛋白Claudin-3是构成细胞间紧密连接的主要功能蛋白，通过细胞间的物理屏障、细胞间旁路转运和信号转导维持细胞内环境的平衡。虽然Claudin-3在相关疾病及肿瘤发生、发展过程中的确切作用机制还不清楚，但是Claudin-3蛋白在肿瘤和正常组织中表达水平存在差异，可利用Claudins家族蛋白表达存在的高度组织特异性，对Claudin-3的表达情况和其调节因子的作用机制进行深入探索。随着分子生物学技术的飞速发展和对Claudins-3结构和功能的进一步深入研究，Claudins-3在多种恶性肿瘤的检测、诊断、治疗中将会成为一个新的靶点。