ITS序列分析在常见动物皮肤癣菌分类鉴定中的应用

阮晨梅

（四川民族学院，四川康定 626000）

皮肤癣菌病是一种浅部真菌感染性皮肤病，呈全球性流行，根据流行区域不同，致病菌种类有所不同。根据生态学分类方式，皮肤癣菌主要分为亲人性、亲动物性、亲土壤性皮肤癣菌[1]。亲动物性皮肤癣菌常寄居于动物的皮肤被毛，可通过直接或间接接触传播，不仅在动物间相互传播，在动物与人、人与人之间也广泛传播，危害较大且不易防治。随着人类生活水平的提高，动物与人的关系愈发密切，由动物皮肤癣菌传染人引起的人兽共患癣菌病也愈发常见。因此，探索高效分类鉴定皮肤癣菌的方法对指导临床治疗具有重要意义。

在针对真菌的鉴定中，内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技术属于一种不依赖病原微生物分离培养的高效分析技术，因其快速、简便和高特异性，显示出极大优势[2]。ITS序列分析技术不受抗生素的影响，能够鉴定出死亡微生物和目前人工难以培养的微生物。通过ITS序列分析可快速鉴定患病动物感染的致病真菌，进一步指导兽医临床用药。

1 ITS序列

1.1 ITS序列的结构

皮肤癣菌的核糖体DNA以串联重复方式构成，由核糖体基因18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA及其相邻的外转录间隔区（external transcribed spacer，ETS）、ITS、基因内间隔序列（intergenic spacer，IGS）构成[3]。ITS序列是位于真菌18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的非编码转录间隔区，包括位于18S rDNA、5.8S rDNA之间的第一内转录间隔区ITS1和位于5.8S rDNA、28S rDNA之间的第二 内 转 录 间 隔 区ITS2[4]。18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA的基因结构保守稳定，异种间存在广泛同源性。对比而言，内转录间隔区ITS1和ITS2在核糖体RNA的加工过程中常被剪切，在进化过程中受到的自然选择压力小，具备更快的进化速度，具有广泛序列多态性，可应用于种间分类的信息位点。

1.2 ITS序列的特点

ITS序列片段短小，具有重复的多拷贝特性，易于获取与分析，特别适合皮肤癣菌属、种级的系统发育和分类研究[5]。鉴定皮肤癣菌的种类时，可根据属种间高变区或特异基因设计特异性引物，直接鉴定至种群水平。研究过程中，常结合病原菌菌落形态学特征、生长特性、生理生化指标等传统分类鉴定方法，提取皮肤癣菌DNA对ITS基因序列进行测序分析，对病原菌的种类进行高效鉴定[6]。结合16S rRNA和18S rRNA基因序列特点，运用高通量测序技术可对动物皮肤样品进行微生物α多样性分析和菌群结构组成分析。有研究表明，了解患病动物病灶微生物多样性情况可为疾病的防控和临床指导用药提供参考[7]。

2 ITS序列分析在常见动物皮肤癣菌分类鉴定中的应用

皮肤癣菌是动物浅部真菌性皮肤病的常见致病真菌，主要寄生于动物的表皮角质和毛发中，可在动物与人之间传播。根据皮肤癣菌中大分生孢子和菌丝结构的不同，可将其分表皮癣菌属、小孢子菌属和毛癣菌属[8]。不同菌属的皮肤癣菌感染特异性不同，毛癣菌属常侵犯动物机体皮肤、趾甲和毛发，小孢子菌属易侵犯动物机体皮肤和毛发，表皮癣菌属侵犯动物机体的皮肤和甲。

3个属中对动物皮肤有致病作用约30余种，在形态特征、生理生化特征上均存在一定的差异。报道常见的致病菌包括疣状毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌，临床诊疗上需要与疱疹病毒感染及其他深部真菌病相区别。临床上常采用荧光染色法和KOH湿片法对浅表真菌进行镜检，但是通过传统的分类鉴定方法区别难度较大，且很难鉴定到种水平[9]。ITS序列分析能够在较短的时间内对动物常见的皮肤癣菌进行分类鉴定，以便兽医临床上对动物皮肤癣菌病的快速诊断和治疗。

2.1 疣状毛癣菌

疣状毛癣菌是一种兽医临床上常见的亲动物性真菌，家畜中牛、山羊、绵羊均易感。临床上炎症表现明显，患病动物头、颈、躯干侧面皮肤常出现脱毛、灰白色痂块。疣状毛癣病严重影响动物生长发育，降低机体抵抗力[10]。疣状毛癣菌在SDA培养基上生长速度较慢，加入维生素B1和肌醇后真菌菌落的生长速度明显提升。分离纯化后的疣状毛癣菌在沙氏培养基上培养1 w可观察到菌落呈灰白色、乳白色或浅黄色，背面未见明显的特征性色素，中心蜡状成堆，边缘呈“杉树堆”，光镜下可观察到链状厚膜分生孢子和鹿角样的菌丝分支。

吴润标等[11]采集患病黑山羊病变皮屑进行病原分离，根据GenBank收录的丝状真菌ITS基因设计皮肤癣菌ITS基因通用引物，测序分析显示目标菌ITS基因序列与Pchelin公布的嗜动物性疣状毛癣菌（T.verrucosum）同源性高达99.99%，结合真菌菌落形态、孢子和菌丝结构确定目标菌为疣状毛癣菌。葛松等[12]对病原真菌ITS序列进行同源性比较鉴定，结果显示，宁夏地区患真菌性皮肤病肉牛的病原真菌与疣状毛癣菌同源性高达99%，系统发育树上属同一分支。基于ITS序列分析，王建昌等[13]确定2013—2014年河北进口奶牛皮肤真菌病患牛分离得到的真菌中有10株疣状毛癣菌，其DNA条形码鉴定结果同形态学鉴定结果一致。

2.2 须癣毛癣菌

须癣毛癣菌是一种常见于人和动物的致病真菌，临床上患病皮肤常出现被毛折断、圆环状脱毛、大量灰白色鳞屑脱落、炎性变化、结痂等病理现象。须癣毛癣菌是一个菌种的复合体，在种内包含许多不同的分型，在形态学上和宿主上呈现多态性[14]。

菌株组成、分型方法的敏感性以及选用标记分子的不同均可得到不同的须癣毛癣菌基因分型结果。根据SDA培养基中菌落的形态特征、尿素酶试验、葡萄糖米饭试验、体外毛发穿孔试验、螺旋菌丝和大小分生孢子镜下结构，可将须癣毛癣菌分为羊毛状、紧密状、绒毛状、粉末状、颗粒状等5个表型[15]。基于含锰超氧化歧化酶（MnSOD）基因序列，对14株人源须癣毛癣分离株和27动物源须癣毛癣分离株进行系统发育分析，可将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5个基因型[16]。基于几丁质酶基因序列同源性差异，可将31株兔源须癣毛癣菌分为5种基因类型；根据菌落形态特征分为颗粒型、粉末型和绒毛型等3种表型[17]。

通过ITS区段和LSU区段分子生物学序列分析，可对狐狸源性菌株的种和有性型做出明确鉴定[18]。刘彦威等[19]利用rDNA-ITS序列分析，结合真菌形态学对河北省兔场患病兔病原菌分离鉴定出兔万博节皮菌。利用通用引物ITS1和ITS4进行PCR鉴定及系统发育学分析，发现趾间毛癣菌为大熊猫被毛样本的优势菌种[20]。

以ITS转录间隔区为靶位，对分离自不同部位的须癣毛癣菌复合体PCR扩增后测序，采用最大似然度法进行序列分析构建系统进化树；结果显示，受试菌株和趾间毛癣菌聚类于同一主支的概率为98%，归类于有性期为万博节皮菌的趾间毛癣菌[21]。

2.3 犬小孢子菌

犬小孢子菌属真菌丛梗孢科中的小孢子属，是一类分布广泛的亲动物性真菌，在我国真菌病重发病率较高。临床上犬小孢子菌常引起头癣，其对皮肤毛发的损伤大，炎症反应明显[22]。犬小孢子菌在葡萄糖蛋白胨培养基上培养后，可观察到菌落从黄白色丝状到白色羊毛状的变化；在马铃薯葡萄糖培养基上培养可观察到黄色的特征性色素；在米饭培养基上可观察到较多的大分生孢子。镜检犬小孢子菌可观察到丝状或球拍状菌丝，顶端膨大呈纺锤形沿菌丝排列的大分生孢子，呈杵状或葡萄状沿菌丝排列的小分生孢子。

刘亭亭等[23]利用ITS序列分析从东北虎林园的东北虎身上鉴定出1株犬小孢子菌。崔丽娜等[24]利用ITS序列通用引物，对山东地区主要兔场的皮肤真菌病分离菌ITS区序列变异及遗传进化关系分析，确定该地区存在犬小孢子菌的流行。李锋等[25]从1例皮肤病患犬体表分离培养病原菌，经形态学初步鉴定后，采用真菌鉴定通用引物ITS1、ITS4对分离菌的ITS区序列进行PCR扩增测序分析；结果显示，分离菌与Gen Bank中的犬小孢子菌（ATCC 36299）的ITS序列（FJ 385030.1）相似性为99%，且在系统发育树上属同一分支。夏继宁等[6]从临床收集的39株皮肤癣菌样本中使用通用引物ITS1和ITS4扩增ITS靶基因，经BLAST工具比对分析，显示其中5株样本菌为犬小孢子菌，且与表型鉴定结果相吻合。有研究利用rDNA ITS测序分析，进一步证实了PCR-HRM分析方法获得的HRM溶解曲线可应用于临床上红色毛癣菌、指（趾）间毛癣菌、犬小孢子菌、堇色毛癣菌等4种皮肤癣菌的初步鉴定[26]。

2.4 石膏样小孢子菌

石膏样小孢子菌与犬小孢子菌同属于小孢子菌属，具有亲土壤性，易感动物可通过接触污染土壤感染。患病动物出现脱毛、断毛，鳞屑，脱毛部位皮肤结痂的现象。

石膏样小孢子菌在SDA培养基上生长迅速，可观察到菌落颜色从白色到棕黄色，形态从绒毛状到粉末状的变化。观察菌落颜色可见中心色深，边缘色浅。镜检可观察到少量呈球拍状、结节状、梳样的菌丝，有棘状突起、壁薄粗糙、椭圆形或梭形的大分生孢子，长于菌丝一侧的杆状无梗小分生孢子。

李明勇等[27]通过分离青岛地区患病兔病原真菌并对其ITS序列进行分析鉴定，表明石膏样小孢子菌在家兔中广泛存在。石膏样小孢子菌不仅存在于家畜中，在一些野生动物中也有分布。为研究大熊猫皮肤病的病因，中国大熊猫保护研究中心对患皮肤病的大熊猫进行了真菌分离及形态学鉴定，并通过ITS序列分析鉴定出分离株为石膏样小孢子菌[28]。钱晶等[29]根据石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、须毛癣菌ITS序列差异设计4条引物，建立多重PCR方法可同时检测3种致病性真菌，方法简便、特异、灵敏，可同时对宠物浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

2.5 其他皮肤癣菌

ITS序列分析在断发毛癣菌、马毛癣菌、红色毛癣菌等皮肤癣菌的分类鉴定中也存在少量应用。基于菌株表型和基因型特征，在rDNA ITS和TEF1序列分析下，表明感染马毛癣菌的无症状患犬可将病原菌传播给人类[30]。观察有宠物犬接触史的成人头部脓癣患者，取其皮损边缘少量分泌物分离培养，观察菌落形态结构，选取真菌培养后菌落提取DNA，扩增ITS区；结果显示，测序分析ITS序列片段和断发毛癣菌的内转录间隔区MH877348.1相似性达到100%[31]。利用红色毛癣菌保守区域rDNA ITS区域设计特异性引物，可快速、准确、敏感地区分红色毛癣菌与其他皮肤癣菌[32]。

3 结论

随着分子生物学的不断发展，皮肤癣菌分类鉴定的方式不再局限于传统的菌株形态特征和生理生化指标鉴定。ITS序列分析的应用在一定程度上弥补了传统方法中主观经验的影响，使鉴定更加快速、简单、客观。但ITS序列分析无法对所有真菌的属种进行鉴别，在实践应用中也存在缺陷，尤其在比对使用的基因库缺乏与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌时。因此，在临床中还需要将传统的真菌学鉴定法与ITS序列分析相结合才能更好地指导实践。真菌ITS序列具有种间特异性，使其在动物皮肤癣菌的分类鉴定及动物癣菌病的预防治疗中发挥非常重要的作用，在动物皮肤病的临床医学检验中具有广阔的应用前景。