丝素蛋白在组织工程修复的研究进展

施心雨，李艾元，李 诚，宣智宏，岳万福

（浙江农林大学动物科技学院、动物医学院，浙江杭州 311300）

组织工程（tissue engineering）属再生医学领域，是结合多学科的原理研发出组织或器官的替代物，可应用于保持、替代、修复、加强病变组织、器官[1]。随着医学技术的发展，组织工程技术领域的出现和发展可弥补难以自主修复机体较大损伤的能力，使人类看到了“再生”的希望。近年来，组织工程为各类组织修复、再生领域不断提供新方向，天然高分子生物材料在组织工程中表现出巨大应用的潜力而得到了国内外大量研究。

丝素蛋白（silk fibroin）作为一种天然大分子，在皮肤、神经、骨[2]等组织工程中作为生物材料展现出巨大的应用潜力。丝素蛋白是一种蛋白质聚合物，在形成不同的材料时具有良好的力学性能、生物相容性和生物降解性、低免疫原性等固有优点[3-4]。同时，丝素蛋白还具有较强的自组装性能，无须化学交联即可加工制成薄膜、水凝胶、颗粒、多孔海绵、三维多孔支架等多种形式的生物材料[5-6]，通过不同改性方法可形成生物支架、高强度水凝胶、药物缓释传递载体等多种形式的复合材料。本文介绍了丝素蛋白的结构、性能，重点讨论总结了丝素蛋白在皮肤愈合、神经连接、血管再生、人造骨骼及人工软组织等领域的最新进展，并对其在组织修复领域的挑战及未来发展方向进行了展望。

1 丝素蛋白的结构和性能

1.1 丝素蛋白的结构

丝素蛋白是一种天然大分子蛋白材料，拥有排列整齐、高度保守的疏水基和结构复杂的亲水基，为其提供了灵活性和稳健性[2-3]。丝素蛋白内含有18种氨基酸，其中11种为人体必需氨基酸。因此，通过蛋白酶的作用，机体内的丝素蛋白可降解成多肽被细胞代谢，无毒副作用[7]。丝素蛋白具有结晶区和非结晶区的混合结构，使分子链整体带负电，对细胞具有一定的吸附作用，具有较好的细胞相容性[8]。丝素蛋白分子由重链（H链）和轻链（L链），通过P25蛋白的二硫键连接而成[9-10]。重链包括疏水性和亲水性块，疏水块能够形成反向平行的β-折叠二级结构[11]，使丝素蛋白具有特殊的机械性能。

1.2 丝素蛋白的性能

丝素蛋白具有独特的结构和性能，如其具有优秀的力学性能、生物相容性、生物降解性能、缓释性等。丝素蛋白具有高强度、高韧性、高柔韧性和高压缩性等力学性能。优秀的力学性能及其在强度、模量、韧性、延展性、重量轻和柔韧性之间的平衡很可能是由丝素蛋白的纳米纤维组装方式所致[12]。在丝素蛋白膜上接种鼠L-929细胞，其生长速度与在胶原上的生长速度相当。在丝素蛋白纤维上接种多种细胞均能够迅速附着并生长，表明了丝素蛋白与细胞的高度相容性。

丝素蛋白的生物降解性主要通过蛋白水解降解，降解程度与丝素蛋白的结构、形态特征以及酶的种类有关。根据降解需要，可利用丝素蛋白植入、力学环境以及形态、浓度等控制降解时间[13]。丝素蛋白内的SilkⅡ结构含量会可明显地影响材料的降解速率，SilkⅡ含量越低，丝素蛋白降解速度越快。

2 丝素蛋白在组织工程修复领域的应用

2.1 皮肤创面修复

皮肤创面愈合是机体最复杂的过程之一，涉及多种细胞类型的空间和时间同步，包括止血、炎症、生长、再生皮化和重塑[14]。受伤后，多个生物通路立即被激活并同步反应。皮肤创面修复过程通常会导致大块组织纤维化，即瘢痕。要做到皮肤创面无痕化修复，需要借助生物支架、皮肤敷料等工具辅助伤口无痕化愈合。丝素蛋白对创面愈合的修复具有较大的优势，无细胞毒性、生物相容性好、利于细胞生长，可为创面提供较理想的愈合条件，利于皮肤创面修复。

Liang等[15]设计了甲基丙烯酰化改性丝素蛋白（SilMA）以研究丝素蛋白水凝胶支架对皮肤细胞再生的机制，采用单细胞RNA测序的方法揭示了不同生物材料对创伤部位的细胞机制，有助于了解丝素蛋白水凝胶介导的皮肤再生机制。试验测试了SilMA水凝胶对大鼠全层皮肤缺损模型的皮肤修复效果，结果显示，与对照组相比，蚕丝蛋白水凝胶支架能够募集更多促再生巨噬细胞和毛囊干细胞；SilMA水凝胶在伤口部位诱导了一个更利于皮肤伤口修复的细胞群结构，能够更显著地抑制皮肤瘢痕的形成并加快伤口愈合，有助于无瘢痕的皮肤再生。

Guo等[16]利用丝素蛋白浓缩自凝结的水凝胶溶液与丝素蛋白溶液混合，在-7℃环境下，利用电场作用调整材料的力学性能，构建了具有血管化功能的丝素蛋白支架，为快速创面修复提供了更多可能性；试验通过冻结温度和排列结构对丝素蛋白支架进行力学调整和物理结构调整，制备出5.9 kPa力学性能定向的丝素蛋白支架；通过丝素蛋白支架体外细胞相容试验、体外血管化能力试验以及大鼠全皮层创面缺损模型等体内、外试验证明，该丝素蛋白支架具有明显的血管化促进作用，并能够加快创面修复速度。同时，该丝素蛋白支架具有促进干细胞向内皮细胞分化的能力并表现出良好的血管生成能力，可促进新血管生成。对创面修复而言，血管化是一个非常重要的影响因素，血管化越快，伤口愈合速度越快。

Qian等[17]在SF中加入金属镓（Ga3+），使SF带负电荷的氨基酸残基物理交联，得到单交联网络；利用血红蛋白（Hb）作为催化剂，构建双交联的SF网络，其中Hb作为模拟过氧化物酶催化SF酪氨酸基团的交联。此双交联的SF混合水凝胶可在伤口原位迅速凝胶化。试验采用标准平板计数法测定水凝胶的体外抗菌作用，DCFH-DA探针检测水凝胶培养的细菌产生的活性氧（ROS）证明补氧性，并通过细胞试验验证水凝胶的细胞相容性。试验结果表明，该混合水凝胶具有良好的生物活性；小鼠全皮层创面缺损模型试验表明，水凝胶敷料能够加速组织修复中免疫调节、新血管形成和胶原蛋白重塑，细菌感染的糖尿病创面在15 d内完全愈合。体内、体外试验证实，双交联混合水凝胶具有优异的力学性能以及蛋白酶响应释放、抗菌活性、增强细胞增殖和防止缺氧的能力，同时可加速启动伤口愈合的3个阶段，成功触发感染糖尿病创面在体内有效、完全地修复。

Wang等[18]利用自组装肽NapFFSV-VYGLR触发丝素蛋白凝胶化，通过非共价相互作用组成一种新的生物活性水凝胶（SV-SF）。该水凝胶具有良好的凝胶稳定性，同时还具有较高的诱导内皮细胞附着、生长和迁移的能力，能够在结构和功能上模拟自然细胞环境，提供支架模拟血管生成因子蛋白的生物功能，促进血管形成。将该水凝胶植入小鼠皮肤缺损区后，对皮肤伤口进行HE切片、Masson染色以及免疫荧光染色等检测，结果显示，水凝胶能够刺激胶原沉积和血管生成相关基因表达，促进血管生成和表皮化，加速表皮修复。合成的新型SV-SF水凝胶具有合成简单、成本低、生物活性高、免疫应答风险低等优点，为促进血管生成提供了另一种途径。

2.2 神经修复

成年哺乳动物的中枢神经系统损伤后形成的胶质瘢痕会导致神经再生阻滞，利用丝素蛋白的水凝胶、三维支架、导管等不同形态促进损伤后神经组织、血管、细胞外基质再生，有助于神经网络的重建以及脑功能恢复。

Sultan等[19]通过混合溶剂高温溶等工艺解冻干制得水溶丝素蛋白，将其与甲基丙烯酸明胶GelMA混合制得增强型水凝胶。通过基因改造骨髓基质细胞（BMSC）使其具备分泌脑源性神经营养因子（BDNF）的能力，利用GelMA/丝素蛋白复合水凝胶包埋BDNF-BMSC细胞；结果发现，丝素蛋白可诱导BDNF-BMSC细胞持续产生更多BDNF诱导神经细胞突触伸展，促进神经修复。研究表明，随着丝素蛋白含量增加，细胞分泌BDNF的量明显提升。将神经细胞与该复合水凝胶共培养，结果显示，含有更多丝素蛋白的组能够诱导BDNF-BMSC细胞分泌更多BDNF且神经细胞的神经突触可伸展更长。

Jiang等[20]通过设计制作一种具有腔体的三维胶原-丝素水凝胶支架3D-CF模拟正常脊髓的解剖结构，利用3D支架，使细胞在体内和体外生长，可观察神经干细胞NSCs与3D-CF联合移植对脊髓损伤修复的影响。结果显示，除假手术组外，3D-CF+NSCs组的神经功能评分明显高于其他组；运动诱发电位测试中，3D-CF+NSCs组潜伏期明显降低，振幅明显升高；磁共振成像和弥散张量成像结果显示，3D-CF+NSCs组脊髓连续性和损伤腔填充效果最好，表明3D-CF联合NSCs植入可促进损伤脊髓的修复。3DCF可填补损伤空洞，促进神经纤维再生，抑制胶质瘢痕的形成，为脊髓白质神经网络重建提供了结构基础，也为脊髓损伤修复过程中轴突寻径提供了良好的方向。

Tien等[21]通过将丝素蛋白涂覆于柔性皮质电极，制备了在水合作用时从刚性转变为柔性的装置；体外测试表明，丝素蛋白膜涂层具备使电极穿透脑组织的机械性能，可减少胶质瘢痕的产生，提高电极的可靠性。此研究的应用范围超越了穿透电极，为丝素蛋白在许多中枢神经系统的应用奠定了基础。

赵晓阳等[22]利用聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜，增加丝素蛋白中带正电荷的基团，并通过神经干细胞（NSCs）的生长及分化的情况判断丝素蛋白对神经干细胞的影响。利用Real-time PCR分析发现，修饰后的丝素蛋白膜上细胞分泌神经营养因子BDNF水平更高，更利于神经和轴突再生。结果表明，聚赖氨酸修饰的丝素蛋白膜能够促进NSCs的增殖活性并减少NSCs细胞凋亡，促进NSCs向神经元方向分化，可为NSCs的附着和生长分化提供良好的生长表面。

Gisbert等[23]通过将透明质酸和丝素蛋白结合制成的管状支架作为神经导管，同时接入施万细胞进行培养；结果显示，加入丝素蛋白后的支架培养的细胞黏附性和增殖率高于纯透明质酸钠。细胞增殖率的提高加速了致密细胞层的形成，该致密细胞层覆盖于HA-SF管的内通道表面。研究表明，该支架在大鼠体内培养后可生成新的胶原细胞外基质和新的血管，促进神经组织的再生。

2.3 血管修复

血管再生是一个高度复杂的过程。在多种组织损伤修复过程中，再生血管可改善创面循环，为组织再生提供基础。血管再生的加快在一定程度上表示组织修复的加快，利用组织工程可制造人工血管，缩短了血管再生的进程。丝素蛋白中特殊的氨基酸排列结构使其具有抗凝血功能，且与合成材料相比，具有更好的生物相容性，可应用于人造血管，更有利于血管内皮化。

Liu等[24]采用丝素蛋白冻干支架再渗透的方法，在丝素蛋白支架中引入铁基磁性纳米颗粒（MNPs），制备了一种新型磁性丝素蛋白支架（MSFC）。与丝素蛋白支架（SFC）相比，该新型支架具有更好的结晶度、磁热性能和机械强度。体内、外试验表明，MSFC的降解时间明显延长，具有良好的生物相容性和促进血管内皮细胞（VECs）生长的作用。该研究证实，引入MNPs在SFC和MNPs间形成了氢键，可显著增强丝素蛋白支架的机械强度，减缓降解速率，促进VECs增殖，有利于长距离血管的修复。

Samal等[25]利用冷冻干燥丝素蛋白及乙醇诱导结晶，制备成三维多孔结构的丝素蛋白支架，在支架中接入人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）和成纤维细胞进行共培养，形成毛细血管样结构。通过体内、外试验结果显示，丝素蛋白支架共培养的血管内皮生长因子（VEGF）水平较高，具有较好的细胞黏附力和增殖能力，血管内皮生长因子受体（VEGFR2）的表达增加，表明这些支架与纤维蛋白结合为毛细血管样结构的形成提供了合适的微环境，能够更好地发展血管网络。

钱春雨[26]将瘦蛋白负载于丝素蛋白，构建了可促进血管愈合并调节血管生成的丝素蛋白纤维膜。试验采用静电纺丝技术制备了丝素蛋白纤维，通过聚多巴胺表面接枝包裹瘦蛋白的脂质体，制成丝素蛋白纤维膜，负载瘦蛋白的丝素纤维具有良好的细胞相容性。体内试验结果显示，将该丝素纤维膜应用于兔口腔黏膜损伤，与对照组相比，负载瘦蛋白的丝素纤维膜愈合情况最快，且愈合后的组织切片显示新生的黏膜分层明显，CD34信号明显；表明负载瘦蛋白的丝素蛋白纤维膜能够有效地促进血管再生，提高口腔黏膜缺损修复速度。

曹传宝等[27]通过调节模具转速、干燥温度、涂覆层数及模具直径控制人造血管的性能及形状，发明了一种抗凝血性改性的丝素蛋白小口径人工血管的制备方法。此技术可根据实际需要制备具有不同力学性能和外形的丝素人造血管，得到的丝素蛋白人造血管具有良好的血液畅通率、生物相容性、血液相容性和较高的机械强度等优点。

2.4 骨组织及软骨组织修复

尽管组织工程取得了重大进展，但骨、软骨修复在目前的临床实践中仍然是主要的挑战。骨、软骨单元是一个完整的功能整体，其组成、结构和功能特性不同，故骨、软骨的再生一直是难点。利用组织工程支架模拟骨组织的结构和功能，可实现对骨、软骨组织的修复甚至替换。丝素蛋白因其独特的力学性能、可调节的生物降解速率和负载细胞能力，可作为一种良好的骨组织工程支架材料[28]。

Li等[29]通过将力学性能和生物相容性好的丝素蛋白与Ɛ-聚己内酯复合，以Sr2+为生物活性因子，制备了半月板支架（SP-Sr）。SP-Sr植入半月板全切除的兔6个月的磁共振成像结果显示，与其他组相比，SP-Sr可有效防止半月板挤压，缓解关节间隙狭窄；通过病理检查证实，其具有软骨保护和延缓骨关节炎发展的作用。支架植入6个月后，新半月板表现出相似的结构成分和力学性能。试验采用湿法电纺法制备的半月板支架具有合适的孔径和足够的机械支撑力，通过一系列材料表征测试和体外细胞研究，证明了无细胞三维电纺PCL、丝素蛋白、Sr2+支架具有保护软骨、延缓骨关节炎发展的作用。

Han等[30]利用丝蛋白支架中植入过表达组蛋白去甲基化酶（PHF8）的骨髓间充质干细胞，在小鼠颅骨中形成临界大小的骨缺损，将表达PHF8修饰的骨髓间充质干细胞植入丝素蛋白支架内，填补至颅骨缺损中。术后2 w，缺损处有少量新骨形成；5 w后，缺损处的新骨形成明显多于其他组。结果表明，丝素蛋白支架内植入PHF8修饰的骨髓间充质干细胞可共同促进小鼠颅骨缺损的骨再生。

Wu等[31]设计了一种结合光固化丝素蛋白密封剂，应用于骨、软骨修复的一体化双层支架的新设计，研究构建了一种以致密、光滑的仿生软骨层（D/S）和负载了BMP-2的多孔层（P/S）为主体，采用负载TGF-β3的丝素蛋白水凝胶（TGF-β3/SilMA）进行边缘填充与密封的完整双层丝素支架。此双层丝质支架软骨层在表面形态和机械强度上类似天然软骨以及bmp-2负载的多孔软骨下骨层，有助于骨髓间充质干细胞成骨分化。负载TGF-β3的甲基丙烯酸丝素密封胶显示生物相容性和良好的黏附性能，并被证实能够促进软骨细胞迁移和分化。在膝关节修复早期，负载TGF-β3的SilMA水凝胶提供了支架软骨层与周围软骨之间的桥梁，引导新软骨向周围原生软骨降解软骨层方向生长并取代降解的软骨层。因此，在体内通过使用此复合材料可实现骨软骨再生和外侧整合。结果表明，丝素蛋白复合材料支架通过内源性细胞实现骨软骨修复，是一种潜在的骨软骨修复支架。

Hong等[32]利用甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白（SilMA），合成了一种光固化生物墨水材料。研究发现，SilMA具有优秀的载细胞数字化（DLP）打印性能、良好的成软骨能力及与天然软骨相匹配的机械性能。试验对SilMA的软骨形成能力进行了体外评估和体内应用。利用DLP 3D打印机的快速打印速度和光聚合作用，使3D产品的细胞分布均匀。SilMA与细胞混合后在体外培养4 w后，通过共聚焦显微镜观察到囊化细胞分化成软骨细胞。此外，对部分缺陷气管兔模型的体内试验显示，在气管周围发现了新的软骨样组织和上皮。该研究表明，负载软骨细胞的SilMA培养系统打印系统提供的水凝胶可促进软骨再生。同时，SilMA水凝胶具有很高的拉伸强度，浓度为30%时，其拉伸断裂应力可达50 kPa，优良的机械性能使其可经受简单的外科缝合而不撕裂。因此，利用DLP 3D打印机制备的SilMA水凝胶可应用于需要打印性等力学性能的软骨组织工程领域。

Kim等[33]采用甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白，通过DLP打印机制备了环状软骨气管，并进行了体外试验。试验结果显示，该软骨器官在体外培养后有软骨组织形成，苏木精-伊红（HE）染色可观察到细胞均匀分布于SilMA水凝胶上，细胞陷窝嵌在嗜碱性细胞外基质中；同时，软骨细胞密集，伴腔隙，周围基质呈进行性染色。在荧光显微镜检查中，软骨细胞在体外生长时间长达4 w。该试验还评价了30%SilMA水凝胶的降解率及其在DLP打印中的潜在价值，结果显示，载细胞的SilMA水凝胶逐渐降解，培养4 w后降解率达到50%，表明硅溶胶凝胶为软骨细胞的生长和软骨形成提供了良好的体外环境。

Li等[34]采用低温挤压3D打印技术，通过辣根过氧化物酶（HRP）介导的丝素蛋白和酪氨酸取代明胶（GT）的交联，制备了大孔SF-GT水凝胶支架。通过物理化学表征分析，发现该水凝胶具有良好的结构稳定性和合适的力学性能，可调节的降解速率，可满足软骨重建的要求。采用细胞悬浮和聚合播种的方法评价了水凝胶支架的细胞接种效率，并对干细胞的软骨分化情况进行了探讨。结果显示，采用细胞聚集播种法时，水凝胶支架中的干细胞分化为透明软骨；采用细胞悬液法时，干细胞分化为纤维软骨，并在兔软骨缺损模型中研究了水凝胶和干细胞的软骨修复作用。该大孔SF-GT水凝胶支架负载干细胞聚集物在软骨组织修复和再生方面具有良好的应用潜力。

3 结论

丝素蛋白可与其他生物材料结合形成复合支架，模拟自然体内环境，提高支架的体内融合潜力，植入目的细胞加速创伤部位的愈合、新生等。丝素蛋白可改性成不同的支架，如可注射和可打印凝胶、多孔海绵和静电纺丝二维、三维结构，通过新的改性技术可预期丝素蛋白基支架具有更多的可能性。

丝素蛋白材料在组织修复领域的应用促进其在生物材料领域的研究，但仍有许多未解决的问题，如目前大多数研究仅限于动物试验，距离真正意义上的临床应用还有很长一段距离；纯丝素蛋白材料缺乏实用性，大多数丝素蛋白需要通过与其他材料复合改性后才能够发挥丝素蛋白的最大优势，制备既保持丝素蛋白原有特性又具有实用性的丝素复合材料是目前主要研究方向之一。随着研究的持续深入，丝素蛋白将为组织工程领域开辟更多元化的发展空间。