浓缩血小板的发展和分类

姚泽欣综述，张 冰，王洁娴，程 飚审校

0 引 言

浓缩血小板(platelet-rich plasma, PRP)是指自体全血通过离心的方法提取出的血小板浓缩物，含有高浓度的血小板、白细胞及大量蛋白。PRP制品主要以富血小板血浆、(富)血小板凝胶(platelet-rich gel, PRG)和血小板裂解液(platelet lysate,PL)等多种形式存在。在20世纪80年代之前，有关PRP的研究主要集中在血液病或凝血系统等血液学领域。此后20年里，血小板中的生长因子被陆续发现。高浓度血小板浓缩液中的生长因子释放至局部损伤组织时，可显著促进修复细胞的增殖、分化与迁移，加速细胞外基质合成，促进局部血管再生和建立有效的微循环系统。多种生长因子的发现掀起了研究血小板与生长因子的热潮。近年来，随着理化分析技术的不断进步，人们对血小板的结构及功能的认知有了新突破，PRP在临床的应用范围逐渐扩大，应用方式也越来越多样化。

随着对PRP的深入研究和临床应用的广泛开展，市面上出现了多种不同性状的PRP制品，也随之出现了不同的命名方式和分类体系。名称的多样性表明不同名称的PRP产品性状可能不同，修复组织的功效也有所区别，但繁多的命名方式也造成了该领域血液制品分类混乱的现象，给广大医务人员造成困惑。因此，本文主要就PRP应用的发展和分类作一综述，旨在汇总现阶段血小板的分类与临床应用，为临床和科研工作理清思路，提供参考。

1 PRP的研究进展

1.1 结构与功能PRP最早来源于输血医学，一直沿用至今。最初人们一直认为血小板只在血液系统里发挥凝血相关的作用，因此仅用于治疗血小板减少症。直到1987年，Witte等[1]将血小板中释放出来并可促进细胞增殖的生长因子命名为血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)，指出生长因子并非储存在血小板的致密颗粒里，而是可能储存在血小板的α颗粒里。生长因子的发现揭示了血小板不仅具有凝血功能，而且高浓度的血小板还能分泌多种生长因子，具有加速止血，加强创面愈合等功效。迄今为止，血小板中已经发现有30余种生物活性因子和纤维蛋白，其中多种因子在止血或组织愈合中起着重要作用[2]，这一发现开启了PRP在临床组织修复的新时代。

PRP的数量和功能与PRP激活后释放生长因子的类型及数量有关，常见的生长因子有PDGF(a-b)，转化生长因子(transforming growth factor, TGF)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor CTGF)和胰岛素样生长因子(insulin like growth factor-1,IGF-1)，但血小板数量和生长因子浓度之间并非呈简单的正相关关系。研究表明，血小板被凝血酶激活之后释放出有活性的细胞因子，与间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞和表皮细胞等靶细胞的跨膜蛋白受体结合，激活细胞内信号蛋白，引起基因序列的表达，指导细胞增殖、基质形成、类骨生成、胶原合成等，从而促进组织修复和组织再生[3-4]。

1.2 临床研究与应用随着对PRP机制和应用的进一步研究，PRP已被广泛应用于心脏外科、眼科、口腔颌面外科、心血管外科、整形美容外科、骨科、神经外科、妇产科及泌尿外科等诸多领域[5-8]，并在多种难治性疾病的治疗中取得了较多成果，证实PRP有促进修复组织的作用。

PRP目前在再生医学领域的临床应用最为广泛，包括促进伤口愈合，治疗脱发，改善皮肤状态和修复肌肉骨骼[9-11]。PRP在伤口愈合的临床应用已经被多项研究所证实。Feng等[12]使用富血小板血浆凝胶治疗76名慢性伤口患者并进行随访，结果表明伤口愈合情况良好，提示富血小板血浆凝胶在治疗慢性伤口方面具有安全性高、继发性损伤少等优势。Shao等[13]在研究中提出PRP的应用作为治疗糖尿病足溃疡的辅助疗法具有广阔远景。Jason等[14]总结了PRP在皮肤病学中的应用，认为 PRP中含有的生长因子具有促进干细胞的新胶原发生，血管生成和增殖以及软组织重塑等功能，在治疗脱发，美容以及改善痤疮疤痕等方面具有发展前景。PRP与激光治疗，微针，皮肤填充剂和自体脂肪注射等其他治疗方式相结合已显示出协同作用，可增强整体美容效果。Chou等[15]讨论了PRP在颌面再生方面的应用，并认为其有望在口腔颌面外科，牙周外科，整形外科和运动医学中得到应用。Davood等[16]探究了PRP在肌肉骨骼病变治疗中的应用，结果表明PRP可缓解疼痛并改善关节功能，在肌肉骨骼疾病的治疗中得到越来越多的应用。

近年来，PRP在生殖医学领域有了新的应用与发展。Zadehmodarres等[17]对10例因子宫内膜生长不良而有冷冻解冻胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)取消史的患者给予了PRP治疗。给药后10例患者均表现为子宫内膜厚度高于7 mm，5例在FET后怀孕。一次妊娠以流产告终，四次妊娠持续妊娠，结果表明PRP可有效诱导子宫内膜发育。Konstantinos等[18]分别对患有卵巢发育不良、卵巢早衰、围绝经期和更年期的四类患者进行了PRP治疗并观察相应激素水平。结果表明，PRP卵巢内输注可有效促进卵泡生成，恢复卵巢功能，提高激素水平。一项关于勃起功能障碍的动物模型数据研究表明，在大鼠海绵状神经损伤后，局部注射PRP可增效勃起功能的恢复[16]。Wu等[19]一项啮齿动物研究亦表明，通过孔内压力和免疫荧光神经染色测量，经血小板源性生长因子浓度优化的PRP可改善勃起功能。

由于活化的血小板可以释放抗炎介质，在临床上可用于与慢性疼痛相关的各种临床病理状况等方面，如运动损伤，骨科病变，脊柱疾病和复杂的慢性伤口，起到减轻炎症和疼痛的作用[20]。在研究神经性疼痛是否会因PRP促进轴突再生和靶向再神经支配而减轻或消退时，发现PRP在缓解轻度至重度慢性神经性疼痛(继发于受损的非再生神经)患者的疼痛方面的潜力。在接受治疗的患者中，所有患者在PRP手术后三周内疼痛开始减轻，神经性疼痛在手术后至少6年内仍然消除或减轻。Koji等[22]回顾了PRP治疗退化腰间盘对椎间盘性腰痛患者的研究并对其影响进行了临床研究评估，所有研究均报道PRP在减轻背痛方面是安全有效的。血小板还可分泌多种具有天然免疫活性的多肽类物质, 被命名为血小板源性抗菌肽 (platelet-derived antibacterial peptides, PDAPs) ，在炎症调节、杀菌、抗肿瘤和治疗脓毒血症等多方面都具有重要的作用[23]。

尽管PRP在临床的功效和应用得到了越来越多研究的证实，但是由于临床使用的PRP制备方法尚未标准化，个体差异化较大，并且来自临床研究的数据十分有限，导致研究结果存在局限性。因此，人们迫切需要在细胞和分子水平上进行基础研究，以提高对PRP作用模式的了解，同时严密设计临床应用研究方案，以便更好地了解和应用。

2 PRP的分类

2.1 激活PRP再生特性是基于血小板活化时生物活性蛋白的产生和释放，包括多种生长因子和细胞因子。长期以来，根据PRP的激活状态一般可将其分为两类，即未激活的PRP和激活的PRP。2018年，国际血栓与止血学会(International society on thrombosis and haemostasis, ISTH)在科学标准化委员会(Scientific standardization committee, SSC)会议上对血小板在再生医学中的应用和新分类系统提出建议，将PRP根据激活状态扩展为三种：无激活剂的PRP、激活的PRP和冻融的PRP[24]。未激活PRP包括血小板、白细胞、纤维蛋白原和血浆内多种蛋白，而激活后的PRP则包含更多分子成分。Xu等[25]和Barrientos等[26]的研究表明，激活的PRP在促进细胞增殖，加快创面愈合等方面均优于未激活的PRP。激活方法、激活时间以及激活时机对PRP的状态均有一定影响[24]。PRP的激活方式有许多种，如加入氯化钙和(或)凝血酶，直接暴露于体内的胶原，进行冷冻-解冻处理、电处理、声波处理以及光处理等[20]。激活方式及激活剂的剂量不同，获得的生物活性成分也不尽相同[27]。杨域等[28]研究证实，凝血酶和钙离子激活PRP后对血小板凝胶形成、生长因子及微囊泡释放的作用有显著性差异。通过加入不同种类和剂量的激活剂来调整PRP释放活性物质的种类和浓度，可满足不同的临床治疗需求。富含血小板的纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)是PRP提取的最新发展，无需对血液进行任何生化修饰，即不需要抗凝剂，凝血酶或氯化钙。迄今为止，这种技术是最简单，也是最经济的[29]。

2.2 离心血小板浓缩制品的制备方法各异，共同之处在于将血浆进行离心处理以富集血小板，但离心方法并无统一标准，常见的离心方法有一次离心法，二次离心法和三次离心法。不同文献对于PRP制备过程中的离心速度和离心时间差异较大，Slitcher等[30]早在1976年提出的两次离心方案为第一次以1000×g离心9 min，第二次以3000×g离心20 min。同年，Kahn等[31]则是以3800 rpm的转速单次离心4 min以获得PRP。随着PRP在临床的广泛应用，对PRP制备技术的研究也逐渐增多，离心力和离心时间更是不尽相同，Croise等[32]统计了2007年至2018年发表的所有关于PRP制备的文献，探究不同离心方法和条件对血小板浓度和(或)生长因子释放率的影响。尽管多种条件都能提高血小板浓度并且达到治疗效果，但离心力过强或离心时间过长时，血小板可能面临被破坏甚至失效的风险。由于使用设备及制备条件的不同，即使在转数和离心时间相同的情况下，离心半径的变化也会导致离心力随之改变，因此在制备血小板浓缩制品时应该标明离心力。Choukroun与Dohan在2006年提出的PRF在制备过程中只需一次离心且不需要添加任何外来物质，被称为“第二代PRP”(针对PRP为第一代PRP而言)[33-37]。在2006年由Sacoo等[38]提出的浓缩生长因子(concentrated growth factors, CGF)是通过特制的不间断变速离心机自动加速和减速离心后提取而成，根据选用的离心管不同，CGF可制成液态、凝胶态和松散凝胶态，满足不同的临床需求。近年来，部分文献认为CGF在生长因子浓度方面优于PRP和PRF，且CGF中富含有较高浓度的CD34+细胞，生物学效应更加高效，并称之为“第三代PRP”。但实际上这些PRP制品各有优缺，三者之间除在开发时间节点上存在先后顺序外，彼此之间的优劣并未泾渭分明。因此，笔者认为将PRP、PRF、CGF进行断代具有一定的局限性，不如将其均视为PRP发展进程中的重要形式，供临床医师各取所需开展研究与治疗。

2.3 白细胞浓度全血经第一次离心后可分为三层：红细胞(RBCs)，缓冲层(buffy coat, BC)和贫血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP)。BC通常呈白色，包含大部分的血小板和白细胞，又称为白膜层。有文献认为，分离白细胞后的PRP可减少微聚物的形成，有利于降低PRP输注后的栓塞发生风险和非溶血性输血反应的发生[39-40]。然而，有研究指出白细胞在PRP中发挥了关键作用，包括抗感染和免疫调节作用[41-44]。此外，白细胞还能产生大量的VEGF[45-46]。血小板中含有相似数量的血管生成刺激物(如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子)和抑制剂(如内皮抑素和血小板反应蛋白-1)[47]，白细胞来源的VEGF对于促进血管生成可能至关重要。因此，Dohan等[29]在2009年提出了按照白细胞含量和纤维蛋白密度对PRP进行分类的方法。根据纤维蛋白密度的不同，可将PRP分为PRP和PRF；根据白细胞的含量进一步分为低浓度白细胞的贫白细胞PRP(pure platelet-rich plasma, P-PRP)和贫白细胞PRF(pure platelet-rich fibrin, P-PRF)，以及高浓度白细胞的富白细胞PRP(leukocyte- and platelet-rich plasma, L-PRP)和富白细胞PRF(leukocyte- and platelet-rich fibrin, L-PRF)。P-PRP是不含白细胞且激活后具有低密度纤维蛋白网络的PRP制剂，最早是作为输注血小板的附加应用而开发的，后来广泛应用于临床的多个学科，促进多种组织的修复和再生。P-PRF同样不含白细胞，但激活后具有高密度的纤维蛋白。这些制品仅以活化的凝胶形式存在，不能像传统的纤维蛋白胶一样注射或使用。L-PRP含有高浓度的白细胞和低密度的纤维蛋白，类似于纤维蛋白凝胶但溶解迅速。开发制备L-PRP方法的最初目的是在没有输血实验室支持的情况下可以在日常实践中使用PRP，因此，在L-PRP的制备方案中，血小板和白细胞通常可被有效收集和保存，但结果的重现率并不理想，往往会导致所使用的PRP成分不清楚。L-PRF被认为是第二代血小板浓缩物[48]，其在制备过程中无需添加任何抗凝血剂或凝胶剂，在低速离心过程中触发血小板活化和纤维蛋白聚合而产生PRF凝块[49]。PRF凝块以纤维蛋白将大部分血小板和白细胞高效收集固定，且不易溶解，可如天然血凝块一般缓慢重塑，具有成本低，操作简便，可大规模生产等优势，已被法国、意大利和以色列等国家列为主要技术[43]。

2.4 多指标分类按照白细胞含量和纤维蛋白密度的分类方式为PRP多指标分类提供了思路。Delong等[50]在2012年提出了PAW分类系统，P代表血小板的绝对数量，A代表血小板激活方式，W代表白细胞浓度高低。PAW系统相对Dohan系统，除白细胞浓度之外，还强调了血小板的绝对数量和激活方式。Mautner等[51]基于前两者的分类系统，加入红细胞的指标，在2015年提出了PLRA分类系统，P(Platelet)代表血小板浓度，L(Leukocyte)代表白细胞浓度，R(Red blood cells)代表红细胞浓度，A(Activation)代表激活。2016年，Magalon等[52]提出了一个更全面的DEPA分类，D(Dose)代表剂量，E(Efficient)代表效率，P(Purity)代表纯度，A(Activation)代表活化。这种分类方式基于四个不同的参数，对全血和最终的PRP制品进行全面质控评估。但这一分类并未考虑到，未激活一类PRP临床应用时，活细胞注入带来的一些影响。到了2017年，Lana等[53]加入更多指标，提出MARSPILL分类系统，更加细化和完善了PRP制品的分类。M(Machine/Handmade)代表机器制备或手工制备，A(Activation)代表激活，R(Red blood cells)代表红细胞，S(Spin)代表离心次数，P(Platelet)代表血小板，I(Image guidance)代表是否使用影像引导，L(Leukocyte)代表白细胞，L(Light activation)代表是否光激活。但这种方法，势必受到限制，因为在血小板活化方面，已有脉冲电场、超声等更多方式出现。

2018年，国际血栓与止血学会(ISTH)在科学标准化委员会(SSC)会议上，将血小板是否激活，样本中血小板的计数范围和制备方法作为分类标准，制定了一系列统一的质控标准并规范了血小板在再生医学中的使用[54]。ISTH分类是迄今为止较全面的分类之一。有研究在2019年提出PRP制品的命名应考虑其变量，如血小板、白细胞、红细胞等，甚至将激活、破裂情况也纳入变量计算之中，这将使不同组间结果比较成为可能，且对于质量评估和注意事项十分重要[55]。2020年，有研究提出了以代码的形式来表征PRP相关参数的新型分类方法，用6位代码(N1N2-N3N4-N5N6)表示[56]。6位序列中的每个数字代表一个特定变量：N1(血液中的基本血小板浓度，如1=100,000-200,000血小板/μL)、N2(PRP中的血小板浓度，如1=100,000-200,000血小板/μL)、N3(PRP中的红细胞浓度，0=红细胞数量<1×106/μL，1 = 红细胞数量>1×106/μL)、N4(PRP中的白细胞浓度，如0=低于基本水平，1 = 1-2倍基本水平)、N5(外部激活，0=未激活，1=激活)和N6(钙添加，0=未添加，1=添加)，旨在快速识别并给出每个研究中使用的PRP类型。

3 结 语

综上所述，经过多年的基础研究和临床应用，PRP修复组织的机理研究和应用都取得了巨大的进展，新的适应证也仍在被持续发现和研究。但PRP的应用仍存在较多争议，主要原因在于PRP制品的多样性或异质性。随着PRP应用的深入发展，越来越多的结构和功能在不断增加血小板的命名难度。分类系统的出现，一定程度上解决了不同研究数据间无法比较的问题，为将来临床根据不同组织、不同治疗目的确定使用何种亚型PRP制品提供数据方案，有助于进一步推动PRP的研究和发展。