去铁胺:促进骨组织再生的潜在因子

曹长红 综述，姚姝博 张圣敏 审校

（沧州医学高等专科学校口腔系 河北 沧州 061001）

骨骼是一种血供丰富的硬组织结构，许多涉及骨组织再生的骨骼组织疾病，如骨坏死、骨缺损和骨质疏松症等，都可能存在着受损或功能异常的血管，而骨骼组织疾病本身也可能干扰骨组织周围的正常血液循环。因此，充分的血流量恢复和骨诱导对骨组织再生的治疗至关重要。去铁胺(Deferoxamine, DFO)作为一种铁螯合剂，常应用于地中海贫血等需要依靠输血治疗的疾病，通过广泛的基础研究和临床观察，其在血管再生方面的优势已经被普遍认可，它可以激活缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通路[1-4]，从而上调血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达进而促进血管生成，此外DFO也被证实可以通过Wnt-β信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[5-6]。DFO已在很多研究中显示出促进骨再生修复的前景。

1 DFO的一般特征

铁是人体重要的微量元素，在氧运输、能量代谢和DNA合成等方面具有重要作用。然而，过多的铁会导致未连接或不完全连接的铁离子与过氧化物反应形成活性氧物种(Reactive oxygen species,ROS)，并会对机体造成很大损害[7]。DFO是一种铁螯合剂，已获得食品和药物管理局的批准，并广泛应用于临床实践中治疗与铁超载相关的疾病[8-9]。DFO通过与Fe3+和含铁血黄素结合形成稳定的复合物，可阻止Fe3+进入到 Haber-Weiss反应体系中，从而避免铁中毒带来的机体损害。DFO的使用通常需要长期口服或输注，临床数据证明DFO的使用无明显毒副作用，具有较高的临床应用安全性[10]，偶有严重过敏，仅在大剂量、快速静脉输注时可能会导致低血压与休克的发生。

2 DFO发挥成骨作用的可能原因及机制

2.1 成血管：血管系统在胚胎骨骼发育和骨骼生长中具有不可替代的作用[11]，而且丰富的血液供应可以为骨组织缺损提供营养物质、生长因子、激素、细胞因子和趋化因子[12]，在骨组织修复过程中同样起着至关重要的作用。血液供应不仅是营养物质扩散、细胞增殖和新骨组织生长的营养递送器官，而且在调控参与骨再生的细胞和信号分子中起着关键作用[13]。组织移植物缺乏血管供应会严重影响组织器官的再生，血管生成缺乏或抑制已被报道是骨再生障碍的主要原因之一[14]。因此，诱导血管形成的能力在骨再生领域具有重要作用。

DFO具有上调HIF-1a和其他关键下游血管生成因子的能力，近年来，人们在许多动物模型中研究了DFO对血管生成的作用。已经证实了DFO在缺血[15-16]、皮瓣成活[17]以及组织血管化[18-19]等方面发挥作用。以上这些研究阐明了DFO在血管化方面可能具有的临床益处，介于血管化与成骨之间的协同作用，因此,推测DFO促进血管化的基础会为复杂的骨组织再生提供可能。

2.2 免疫调节：骨损伤后的修复过程是一个涉及各种细胞类型和细胞外环境之间相互作用的高度有序过程。以巨噬细胞为主的免疫细胞不仅集中参与在创伤早期，也存在于整个骨修复过程中。巨噬细胞在成骨分化中的作用已被广泛证实，相关动物实验的研究表明，没有巨噬细胞的直接参与，骨折将不会愈合[20]。

Gong L[21]研究了鼠骨髓巨噬细胞对transwell共培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨的影响，该培养环境中显示出M1巨噬细胞抑制和M2巨噬细胞增强，并促进了小鼠骨髓间充质干细胞介导的骨生成。在M1巨噬细胞中观察到促炎细胞因子的显著下调，而在M2巨噬细胞中观察到转化生长因子-β(TGF-β)，VEGF和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的上调。作者推测M1巨噬细胞的促炎作用被破坏，并且M2巨噬细胞中生长因子的上调（M2极化）促进了骨形成的增强。Park SM[22]发现经DFO预处理的犬脂肪干细胞可促进前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α刺激基因-6等抗炎因子的分泌，并可以更有效地引导RAW-264.7细胞M2极化。Oses C[23]等观察了人脂肪组织源性间充质干细胞(AD-MSCs)在不同剂量DFO作用后各种细胞分泌因子的变化，并发现对干细胞进行DFO预处理可以促进抗炎因子如白细胞介素-4和白细胞介素-5的分泌。白细胞介素-4是已知的巨噬细胞M2极化的诱导剂，这也表明被DFO预处理可能在巨噬细胞M2极化发挥作用。周颖等[24]利用DFO干扰素γ处理人牙髓干细胞，并在体外研究中证实预处理的细胞可以增强抑炎因子的分泌，在体内研究中预处理的细胞可以更好地发挥免疫调节作用。介于DFO可以促进巨噬细胞M2极化，而巨噬细胞M2极化可以促进成骨的发生，笔者推测DFO促进成骨的因素可能与此有关。

2.3 高铁环境调节：正常人体内铁元素的含量在一个相对稳定的状态，过量铁和过氧化氢结合会产生铁离子(Fe3+)和活性氧物种(ROS)，它们的持续产生会导致长期炎症反应，进而影响组织再生。在近来的一些研究中[25-26]，已经证实在骨质疏松类骨折患者中存在血清铁含量过高问题。而体内过高的铁含量同时被证实会抑制成骨细胞的活性，不利于骨创面的愈合。改善高铁环境在此类型的骨折愈合中可能具有重要作用。张鹏[27]的研究证实了成骨细胞分化在高铁环境中会受到抑制，通过DFO的干预能够较为有效地恢复高铁环境下的成骨细胞分化效果，这提示DFO在高铁环境下能有效促进成骨作用。汪升[28]的研究也证实DFO可以改善骨质疏松后的铁过量，并恢复成骨的相关指标。通过以上研究，笔者推测局部应用DFO可以逆转铁蓄积导致的骨损伤表面的铁过量问题，进而恢复有效的成骨效果。

2.4 可能参与的信号通路

2.4.1 HIF-α信号通路：诱导血管生成的关键信号分子包括缺氧诱导因子-1 α (HIF-1α)、人重组Nell-1蛋白（Nell-1）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞衍生因子（bFGF）和VEGF等。HIF-1α信号通路被证实可通过提高成骨细胞中VEGF水平来促进血管生成和成骨，在骨发育过程中激活HIF-1α通路可以协调骨中新血管形成的时间、方向和程度，从而增加骨重建过程，HIF-1α信号通路在正常骨骼发育中必不可少[29-30]。DFO已被证实能够上调HIF-1α信号通路，这可能是DFO在成骨和成血管中发挥作用的重要原因。

2.4.2 PI3K/AKT信号通路：郑胜武[31]的研究证实DFO可以激活PI3K/AKT信号通路，从而促进缺血下肢血管化。Ding J[32]的实验结论认为，低剂量DFO刺激的骨髓间充质干细胞(MSCs)外泌体，可通过PI3K/AKT途径促进新生血管的形成。而PI3K/AKT信号通路的激活也被认为可以直接促进干细胞的成骨分化[33]，可以推测DFO成骨作用的促进可能与PI3K/AKT信号通路的激活有一定关系。

2.4.3 β-catenin信号通路：Qu ZH[34]将DFO和骨形态发生蛋白-2(BMP2)同时作用于多能人间充质干细胞和小鼠间充质C3H10T1/2细胞，DFO促进了多能人间充质干细胞和小鼠间充质C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性和钙沉积。另一方面，DFO增强C3H10T1/2细胞中糖原合成酶激酶-3(GSK-3 b)的磷酸化，激活β-catenin信号通路，这些数据表明DFO可能通过激活β-catenin信号通路在骨髓间充质干细胞分化中起直接作用。Genetos DS[35]的研究结果显示缺氧和模拟缺氧DFO增加β-catenin基因活性，增加BMP拮抗剂gremlin和noggin的表达，并降低Smad-1/5/8磷酸化。

3 DFO在骨再生中的应用

研究结果表明，DFO在骨折、牵张成骨、骨质疏松及骨缺损中都能发挥显著的成骨作用。按DFO在骨再生中发挥作用的方式，将其分为体内注射法和组织工程载药支架。

3.1 注射法：将DFO注射到创面周围是发挥DFO作用最直接的方式，这种方式已经在骨折、骨缺损、牵张成骨及骨质疏松中应用，并促进了相应疾病的骨创面愈合。但这种方式也面临着需要反复多次注射，以及最佳注射剂量及疗程没有定论等问题。

3.1.1 骨折：骨折是最常见的骨创伤疾病之一，Donneys A[36]等证实了DFO在骨折愈合方面可能发挥优势作用。研究者利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行体外研究，证实高剂量的DFO(50μM)处理的细胞在短时间内就能获得显著优于对照组的良好血管网络。SD大鼠体内实验也证实，DFO可显著改善血管形成，同时发现与未经治疗的骨折相比，DFO治疗组的骨愈合发生率更高。Shen X[37]建立小鼠股骨骨折模型，通过直接在骨折处注射DFO，证实DFO可通过激活HIF增加骨折后血管新生和骨形成。

3.1.2 牵张成骨：牵张成骨是促进骨再生的一种技术。Farberg AS[38]的实验研究验证了DFO在牵张成骨中的应用前途，研究者选用两组大鼠(n=12)接受牵张成骨手术。在牵张阶段，实验DFO组(n=5)在牵张间隙内注射DFO。结果证实与对照组的再生骨相比，DFO处理组有明显骨细胞增殖。证实DFO可有效使骨细胞和骨体积分数显著增加。Wan C[39]的实验也验证了DFO对牵张成骨可能发挥的作用，通过将DFO注入在小鼠的牵张间隙，发现DFO可促进血管生成并显著改善骨再生。

3.1.3 骨质疏松：DFO在骨质疏松中可能发挥的优势作用也已被很多研究者所证实。Wang L[40]课题组认为促进骨中血管的形成是治疗骨质疏松症的一种潜在的临床治疗方法。其研究团队对DFO在去卵巢诱导的骨质疏松症小鼠模型中的作用进行了深入研究，结果证实DFO治疗不仅部分阻止了骨丢失并维持了骨小梁的微结构，而且在去卵巢后的第1周还增加了H型血管的数量。DFO可能通过促进H型血管的形成为改善骨质疏松症提供新的靶点，但作者并没有对DFO影响H型血管调节骨代谢的分子机制进一步展开研究。郑妮娜[41]利用雷洛昔芬联合甲磺酸去铁胺治疗绝经后骨质疏松，经过为期6个月的观察，发现治疗总有效率为100%，骨密度及骨代谢指标均有所改善。笔者认为这可能与绝经后骨质疏松患者会出现血清铁水平升高有关，血清铁水平升高会造成机体铁超负荷，铁超负荷会对骨代谢产生不利影响，而甲磺酸去铁胺的应用逆转了这一过程。

3.1.4 临界骨缺损：杜文瑜[42]等在大鼠颅骨制备临界骨缺损，并于手术后第4天在骨创面皮肤注射DFO，研究结果表明，通过梯度时间提取标本并通过免疫组化等染色证实DFO可以有效促进临界骨缺损的血管新生和骨生成。以上研究结果均证实了DFO可能在优化骨折、牵张成骨、骨质疏松、骨缺损的骨形成方面有实用价值，并为未来的骨损伤治疗带来更好的选择。由于药物普遍存在的半衰期问题，单纯注射可能存在局部释放浓度不能长久有效维持，并且注射DFO可能会导致不能准确将足够的药物输送到期望部位的问题。因此，对骨缺损的治疗更多的研究通过设计组织工程骨支架来实现。

3.2 组织工程载药支架：为了解决局部注射DFO血管滞留半衰期短，药物可利用性差的问题，组织工程DFO载药支架被研发。一个理想的载药材料应该在生物相容性，与骨再生相匹配的可降解性及缓慢持续有效释放方面符合骨缺损对载药支架的需求。众多研究者利用不同的技术实现了DFO在支架的装载。

Jia P[43]将DFO滴加到多孔聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架表面，冷冻干燥后合成PLGA/DFO载药支架，DFO在7 d内释放80%左右，28 d基本释放完全。研究结果证实DFO可促进体外成骨分化和血管生成。体内结果证实PLGA释放的DFO促进骨质疏松性骨缺损的愈合。Yan Y[44]将DFO应用于骨组织工程实验研究以验证其对骨缺损的治疗价值，研究者通过表面氨解和层层组装技术制备了一种3D打印的可生物降解支架，它可以控制DFO的有效释放。DFO负载支架在前20 h之内具有快速释放特性，之后释放相对较慢，120 h释放接近90%。通过体外研究表明，该支架促进了骨髓间充质干细胞成骨分化和成骨基因的表达，同时促进了人脐静脉内皮细胞血管形态的形成。体内实验结果表明，DFO可促进大鼠骨缺损模型中缺损部位的血管生长和骨再生，证实了缓释DFO的可降解支架对骨缺损发挥的作用。Yao Q[45]开发了一种新型的介孔硅酸盐纳米颗粒(MSNs)联合纳米纤维明胶(GF)组成的3D复合支架，用于装载骨形态发生蛋白2(BMP2)和DFO形成新式双重给药系统，DFO可在支架持续释放10 d，结果显示DFO的释放显著促进了BMP2诱导的成骨分化，表明DFO的添加对成骨具有加强作用。Li H[46]基于多巴胺(DOPA)的自聚反应，将DFO修饰到聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)膜表面，结果发现由DFO修饰的膜更有利于MC3T3-E1细胞和人脐静脉内皮细胞的附着、增殖和铺展，PDLLA/PDOPA-DFO复合膜不仅有利于成骨，而且能显著促进血管生成。Ran Q[47]采用二氧化钛纳米管(TNT)作为药物纳米储存器负载DFO，然后通过逐层组装(LBL)技术沉积壳聚糖(CHI)和明胶(Gel)多层覆盖结构，得到TNT-DFO-LBL支架，其所构建的支架TNT-DFOLBL在12 h DFO释放率相对较低，约为47.6%，后期释放稳定、适度，7 d释放90%左右。研究结果发现，TNT-DFO-LBL支架可通过激活HIF-1a信号通路上调骨髓间充质干细胞成骨和人脐静脉内皮细胞血管分化相关基因的表达，促进了成骨和成血管。以上研究均利用DFO构建了支架材料，并验证了DFO可在成骨和成血管方面发挥双重作用。

目前，DFO载药组织工程支架对成骨和成血管效果已经得到了普遍的公认，且其设计在生物相容性、可降解性及释放时间方面都取得了一定进展，然而DFO在载药支架中的释放依然普遍存在早期快速释放，后期缓慢释放的特征。使载药支架同时满足与骨新生相匹配的降解和在药物释放量上得到长期稳定缓慢的释放依然是未来支架设计研究的重点。

4 展望

DFO是一种铁螯合剂，已获得食品和药物管理局的批准，并广泛应用于临床实践中治疗与铁超载相关的疾病。其在血管再生方面的优势已被普遍认可，目前很多研究者开始将去铁胺的研究范围扩大到了骨组织再生领域。DFO在体内发挥作用的方式主要有局部注射和载药组织工程支架两种，局部注射和载药组织工程支架都已经展现出了良好的骨再生效果，但DFO最理想的剂量，临床可能存在的副作用和最合理的用药方式如支架设计方案和注射疗程也还有待进一步深入研究。