农业微生物细菌发酵工艺研究进展

李 恒,万邦隆，董 芸，孙玉翠，李洪姝

(云南云天化股份有限公司研发中心，云南 昆明 650228)

进入21世纪以来，我国大力生产有机绿色产品，推崇发展健康绿色农业。正是由于人们健康和环保意识的逐步增强，开始对食品安全、土壤安全、环境保护等加以重视。这就要求我们在促进农作物生长时，不仅要提高产量，也要注重产品质量，而且还不能造成有害物质产生和积累，不污染土壤和环境。因此迫使我们寻找一种能够降低化肥施用量，提高农作物的产量和农产品的质量，降低农产品中有害物质含量的健康环保的物质。研究显示,农业微生物恰好具有促进有机质腐熟、提高土壤养分、减少土壤重金属的富集、促进农作物生长、减少病虫害发生、提高作物品质等作用。因此，农业对农业微生物类试剂、肥料的需求将大大增加。加之，国家大力实施化肥、农药零增长行动，促进节本增效、节能减排,保障国家粮食安全、农产品质量安全和生态环境安全，实现农业可持续发展，这为研究农业微生物提供了一个很好的发展机遇。目前，农业微生物类试剂和肥料活跃在国家生态示范区、绿色和有机农产品基地等，它们正在农业生产中取得越来越明显的经济效益、社会效益和生态效益。

1 农业微生物的发展及细菌发酵的意义

我国是一个农业大国，种植作物、地理环境、病虫害发生及其复杂多样。加之，传统农业化肥施用量大，使用结构不合理，施用技术粗放等，使得化肥利用率低，并造成环境的污染恶化和土壤生境产力的下降。生态环境治理和农业健康可持续发展迫在眉睫，这为农业微生物的研究与应用提供了一个良好的契机。

目前，农业微生物研究工作主要包括肥效微生物、生防微生物、饲料/酶制剂微生物、环境/能源/转化微生物等的资源开发、监测、评价、发酵工艺研究等。我国的农业微生物研究工作起步较早，但发展相对缓慢。自改革开放以来，我国农业微生物在微生物肥料、微生物饲料、微生物农药、微生物降解和微生物活性物质等多个领域均取得了较大进步，但我国农业微生物基础研究较弱，评价、效应监测、功能筛选与发酵工艺等技术手段不规范，缺乏监测评价模式的研究与集成，对效应评估、开发利用和支撑工艺都还有限。

农业生产中常用的微生物是细菌、放线菌、酵母和霉菌，其中使用最广泛的是细菌。细菌是所有生物中最丰富的类型，并且是自然物质循环的主要参与者。根据其生长形态可分为：球型菌、杆型菌和螺旋型菌(包括弧型菌，螺旋菌)；根据其生活方式可分为：自养细菌和异养细菌(包括腐生和寄生细菌)；根据其需氧状况可分为需氧型(全需氧和微需氧)和厌氧型(不完全厌氧，有氧耐受和全厌氧)细菌；根据细菌的生存温度可以分为低温、常温和高温三种类型。细菌发酵是一种生物过程，它利用细菌的特殊代谢途径将原材料转化为目标产物。细菌发酵有两种：厌氧发酵和有氧发酵。发酵方式多样，产品类别繁多，用途广阔。发酵细菌结构简单，并具有许多特殊的代谢途径，它用于农业生产：直接参与有机物的腐烂和分解，促进土壤和作物养分的转化；活化土壤中的养分，调节土壤的微环境，保持土壤的健康活力；降解土壤中的重金属并减少有害物质的富集，保护土壤和农作物的健康状况；拮抗有害病原菌，减少有害土壤细菌和农作物病害的发生；形成肥料效率，生物防治和降解的特定功能。

细菌的发酵过程，又是一个复杂多变的过程，每一种物质和微环境的变化都会导致不同的结果产生。因此研究细菌发酵工艺中的影响因素，优化技术，确保菌体稳定、安全、高效生产，从而为后续细菌类微生物改善土壤环境，促进安全生态农业的健康可持续发展提供依据，这对促进传统农业产业结构转化以及农民增收等具有积极的推动作用。

2 细菌培养基配方的优化

近些年来，我国微生物的发酵研究处于全新的发展阶段，在发酵基质选择及发酵条件优化方面都做了很多的研究。普遍通过单因素实验、正交实验、响应面法中的一种或几种方法研究相应细菌菌株的最优发酵培养基，影响细菌发酵影响因子液有发酵液的配比组成、发酵液浓度等等。细菌繁殖的培养基成分主要有碳源、氮源、无机盐、微量元素和生长因子。其中常用碳源物质有葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、牛肉膏等；常用氮源物质有蛋白胨、黄豆饼粉、玉米粉(浆)、酵母浸膏、尿素等；常用无机盐物质有硫化酸铵、硫酸镁、硫酸铁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、碳酸钙等；常用的微量元素为Fe、Zn、Cu等；常用生长因子物质有维生素、某些氨基酸、脂类、嘌呤、嘧啶等。很多的天然原料，如牛肉膏、麦芽汤、玉米面、豆芽汁等，含有细菌生长所需的无机盐、微量元素以及生长因子，因此在使用此原料时不需额外添加这些物质。

对于不同的微生物，由于所需的营养不同，培养基成分也不相同。但配制的营养要求都要遵循以下的原则：①营养成分要包含微生物的生长需求。不同类型的微生物对营养成分的需求不同，应根据微生物对营养成分的需求来最佳配制。②营养成分的含量及物质配比要恰当。如果营养物质的含量太少，则无法满足其对应微生物生长的需要；如果营养物质的含量太多，相反会抑制其微生物的繁殖。糖和盐浓度高有抑菌作原用。营养物质的碳氮比例(营养物质中还原糖的质量分数与粗蛋白的质量分数的比值)，一般为 100∶0.5～2。③在进行培养基成分配比设计时，还要考虑到各营养成分之间的相互反应。例如，蛋白胨和酵母膏在有磷酸盐成分和高温条件下，会与其中的钙作或镁离子发生反应形成沉淀物质；在高温条件下，还原糖还会与产蛋白质或氨基酸发生反应而形成褐色物质。④在设计营养物质配比，特别是在规模化生产发酵用的培养基时，还要注意培养基营养物质的来源和价格信息，尽可能选择原料来源便利、价格实惠的培养基。

很多学者对细菌发酵培养基做了大量的摸索。例如，侍宝路等[1]对产细菌素乳酸菌进行研究确定其最佳发酵条件;贺晓凌等[2]研究产细菌纤维素菌优化确定了发酵条件和发酵配方;孔菲等[3]对产色素海洋细菌(Planococcussrifietoensis)发酵研究确定了最佳碳氮源;朱孔亮[4]曾用泡菜中分离得到的菌H3为出发菌株研究得出了较优培养基配方；刘大为[5]以嗜酸乳杆菌(Lactiobacillusaciadopluilus) La-1为研究对象，确定乳酸菌增殖培养基配方；等等。

在枯草芽孢杆菌方面，王亚君[6]探索了枯草芽孢杆菌(Baciillussubtilis)HL-1的优化培养基配方；陈羽[7]确定了枯草芽孢杆菌液体发酵最优培养基配方的碳源是葡萄糖，氮源是牛肉膏，无机盐是磷酸二氢钾，最佳含量分别为：葡萄糖 12.11 g/L、牛肉膏 23.31 g/L 和磷酸二氢钾 2.33 g/L。此外，在巨大芽孢杆菌的发酵研究上也有报道，王金玲等[8]研究了巨大芽胞杆菌的最佳培养基质组成；韦杏花[9]在巨大芽孢杆菌基础培养基研究中筛选得到最优营养物质为味精发酵废液，配方为：牛肉膏 1.0 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、味精废液稀释80倍、CaCO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、H3BO30.02 g/L。

不同芽孢杆菌，培养基配方也不尽相同。根据不同培菌的需求，进而设计不同的培养基配比。杨悦等[10]在研究植物乳杆菌时，优化发酵培养基配方为：葡萄糖 34.07 g/L、酵母浸粉 18.12 g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸锰 0.16 g/L、乙酸钠 5 g/L、硫酸镁 0.20 g/L、柠檬酸铵 1 g/L、吐温 801 ml/L、胡萝卜汁 50 mL/L，蒸馏水 1 L。贾玉香等[11]在对根瘤菌产胞外多糖发酵培养基配方进行优化，得到最优培养基配方为:麦芽糖 22.5 g/L、大豆蛋白胨 9.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、KH2PO40.41 g/L、NaCl 0.1 g/L。杨铿等[12]在研究解磷芽孢杆菌YC4时发现其发酵的培养基最佳配方为：糖蜜 1.0 g/L、大豆蛋白粉 5 g/L、酵母膏 5 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L、硫酸镁 1.5 g/L、氯化钠 15 g/L、玉米浆 5 g/L。陈敏等[13]在进行解淀粉芽孢杆酵菌SC1150菌株发酵培养养条件研究时，得到培养基营养物质的最佳配比为：可溶性淀粉(碳源)0.5.%、蛋白胨和酵母粉(1∶1的氮源)1.15%、NaCl 0.1%。单因素筛选及正交试验是最常见的培养基发酵优化的方法。例如，蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)AR156、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳杆菌L621及嗜热链球菌S800的培养基发酵优化[14-17]。此外，对棉铃虫(HelicovaerpaarmigeraHubner)有较高活性的苏云金芽孢杆菌Bt A3 22菌株的培养基进行优化过程中，筛选出了最佳培养基配方[18]。除芽孢杆菌外，很多细菌的发酵最佳培养基配方也采用了此方法[19-22]。

由此可见，不同类型的细菌培养基需求不同。最佳培养基配方需要根据需求不断改进，以至获得最优的培养基配方，达到实验目的。研究应结合菌株的不同特性选择相验应培养基和试剂，再通过实验研究摸索出最优培养基浓度。

3 细菌发酵条件的优化

影响细菌发酵条件有时间、温接度、pH、接种菌龄、接种量、摇瓶装液量、摇瓶转速及溶氧量等，其中摇瓶装液量和摇瓶转速与溶氧量有直接关系。不同细菌对其发酵温度、所需的酸碱环境、对氧的需求量、不同时期生长量均不相同。

细菌发酵条件方面，前人也做过很多的研究。赵航等[23]对葡糖醋杆菌J2-1利用单因素试验和正交试验，确定其发酵培养基最优组分为：葡萄糖 80 g/L、酵母粉 18 g/L、乙醇2%(体积分数)、Na2HPO4·12H2O 3 g/L、乳酸 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L；张炎等[24]副干酪乳杆菌HD1.7利用单因素试验和正交试验，确定其最佳发酵条件为接种量为3%，接种龄为 18 h，装液量为 2 L/3.7 L，初始pH5.5，通气量为 0 L/min，转速为 400 r/min、培养温度为 35 ℃、培养时间为 24 h；董菲菲等[25]通过单因素实验考察温度、pH、搅拌转速、通气量和不同流速的玉米浆对盐沼盐杆菌的影响，发现最佳发酵条件为：温度 37 ℃、转速 250 r/min、通气量 13 m3/min；卜春亚等[26]确定了草莓根的腐病菌拮抗细菌GF-162最佳发酵条件；王聪等[27]对菌株AZ16星箭头菌(Sagittulastellate)进行研究，确定了其最佳发酵条件为：盐度2.5%、接种量5.0%、pH7.5、温度 33 ℃。

不同类型的芽孢杆菌最佳培养条件也不相同。王金玲[28]对巨大芽孢杆菌研究显示，其最佳生长条件为：250 mL 三角瓶的装液量为 20 mL 、pH8.0、菌种接种量3%、摇床转速 250 r/min、温度 30 ℃、培养时间 22 h;梁晓辉等[29]研究结果显示解磷巨大芽孢杆菌JL-1培养的最佳条件为：温度25～30 ℃，pH 6.0～7.0，接种量5%;屈俊廷等[30]优化了解淀粉芽的孢杆菌Y-S-Y12菌株的发酵条件，确定其最佳条件为：时间 72 h，温度28～33 ℃，摇床转速 150 r/min，初始pH 6.0；车晓曦等[31]对解基淀粉芽孢杆菌的发酵研究得出其最优发酵条件，最佳培养温度为 31 ℃、最佳培养转速为 180 r/min、最佳发酵时间为 26 h、最佳发酵初始pH值为6.02、最佳接种量为1%。利用Placke响tt-Burman设计及响应面法确立产Macrola ctin A抗生素海洋解淀粉芽孢杆菌的最佳发酵条件，其初始pH值为6.0，最适培养温度为 29.9 ℃，最适装液量为52.3%，最佳摇床转速为 1130 r/min，接菌量为10%，最佳培养时间为 7 d[32]。而蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)DLSL2的最佳培养条件的温度为 30 ℃、初始pH值为7.0[33]。

培养温度、培养时间及pH值是细菌发酵的重要条件。例如，解淀粉芽孢杆菌15-1-1的最佳生长培养条件为：培养温度 32 ℃、培养时间 36 h、初始pH值7.0[34]；解淀粉芽孢杆菌11568的最佳培养条件为：pH7.5、温度 40.9 ℃、时间 2 d[35]；解淀粉酵芽孢杆菌MH71的最适发酵条件为培养温度 30 ℃、发酵起始pH7.0、发酵时间为 3 d[36]；解淀发粉芽孢杆菌HF-01的最适生长条件为：温度 28℃，初始时间 48 h、pH值6.0～6.5[37]。可见，不同种的解淀粉芽淀孢杆菌，其最适培养条件也不同。

此外，利用单因素试验和正交试验对生防菌株FS6的培养基成分和培养条件进行研究，确定其最优发酵条件[38]；也研究了发酵温度、摇床转效速和培养时间对发酵液抑菌效果的影响[39]；还研究了溶藻细菌R2的最佳化培养条件，最佳培养温度为 31.8℃、最适pH为7.21、摇床最佳转速为 180 r/min、最佳装液量为60%、最佳接菌量为10%[40]；还研究了内生细菌YBSH106的最适培养条件，最适pH为7.0、最佳培养温度为 28 ℃、最佳培养时间为 3 d，最佳接菌量为4%，揺床最佳转速为 200 r/min[41]。魏娇洋等[42]通过比较发酵液的生物菌量，得出内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamynloliquefaciens)X-278最佳发酵培养条件。嗜酸乳杆菌细菌素LaXctobacillin XH1的最佳发酵条件为培养基初始pH6.5、培养温度 35 ℃、接种量为2.5%和培养时间 28 h[43]。

通过对微生物K-6-9的始液体发酵条件的探讨研究，确定其最佳发酵条件为：发酵液初始pH7.0、250 mL 三角瓶装液 50 mL、接菌量2%、培养温度 37 ℃、摇床转速 180 r/min、培养时间 18 h[44]。也研究了湘2-3菌的发酵条件，得出最佳发酵时间为 1 d，最佳发酵温度为 28 ℃，最适菌龄在 18 h～22 h，最佳接菌量为4%，摇床最适转速为 210 r/min，瓶子最优溶氧量为 100 mL/150 mL[45]。通过对烟草内生细菌B-001菌株的发酵条件研究显示：最佳通气量为 100 L/h，摇床最适转速为 220 r/min，最佳培养温度为 30 ℃，培养基的起始pH为8.0，最优培养时间为 2.5 d[46]。可见，转速和时间也影响着细菌发酵条件的变化，应根据生产需求时时进行改进和优化。

综合来看，微生物培养条件的优化调整要根据具体的菌种决定，但在发酵过程中要严格按要求进行操作，发酵条件优化调整有：①不同菌株对温度的敏感性和耐受度不同，发酵中应严格控制好温度。②pH的调节一般通过添加酸碱或氨养水来调节，但是通过流加营养液的方式来调控更加便利，既调节了pH，又给菌株提供了新鲜充足的营养液。③溶氧量：三角瓶可以通过调节转速和瓶子的装液量来进行调节，若要高溶氧量，可以减少装瓶量和调高转速来实现；若要低溶氧量可以增加装瓶量和降低摇床转速来实现。通常装液量最好不要超过瓶子体积的一半。发酵罐可以通过调节其进气量、罐压和搅拌转速来调节溶氧量，不同发酵时期要严格控制好三者的参数。④接种量根据菌株的繁殖速度和装瓶液的多少来加减。一般接种量在10%以内，根据摇瓶和发酵条件来添加。

4 农用微生物菌肥发酵自工艺的优化

目前，直接来自要于农田的农用微生物菌肥主要涉及烟杆、畜禽粪便、菌糠等方面。苌豹[47]以单因素实验方法研究，将实验室的固氮菌N1、解钾菌K3、解磷菌FL和新筛选到的12株菌与菌糠一起进行半固态发酵，制备出了菌糠微生物菌肥；这种半固态发酵的最优发酵条件为：氮源为蛋白胨(浓度为0.2%)、无机盐为磷酸氢二钾装(浓度为0.2%)、装液量70%、装载量为 400 g/L，固体颗粒蛋直径60目、初始pH值7.0、温度 30 ℃、转速 200 r/min。周熠等[48]研究将湿料烟杆和鸡粪按质量1∶1比例混合均匀，然后分别加入1%的高温蛋白酶发产生菌Lys-068、耐热芽孢杆菌酶Lys-768和生防菌哈茨木霉菌剂ACCC3028再次混合均匀，进行固态发酵，可以大大缩短发酵周期。杨晓磊等[49]研究发现将有机原料与味精下脚料调酸辅料混合均匀，间歇性发酵60 d，就可获得标准的有机肥料产品。王琦源[50]在资源化利用畜禽粪便研究中，发现其最优发酵工艺为：碳氮比30 ∶1、含水率70%、接菌量0.35%、4 d翻堆一次；15 d后需加入1%含氮、磷、钾元素的有益菌液，之后每天翻堆，5 d后发酵完成。王健博[51]对堆肥参数进行优化，确定了最佳的发酵参数为：复合菌剂比例为1.5∶2∶1.5∶2，接菌量为1.255%，初始含水率为50%～60%，初始碳氢比为27∶1，堆肥翻堆天数为 3 d，结果表明此法秸能够大大的缩短试验中猪粪秸秆混合物的堆肥的腐熟时间。

一定比例的菌剂加入到有机肥中，能够促进有机的腐熟期，大大缩短有机肥的发酵周期，减少生产时间投入，减少秸秆和畜禽粪便对土壤和环境的污染，能使废弃的有机资源得到合理利用，变废为宝，形成集化环保生产模式。加之菌剂对农作物病害的拮抗作用和菌剂在土壤中的修复降解等功效，形成特定功能的生物有机肥。有效保护了耕地土壤健康, 提高微生物有机肥的竞争力，增强农业可持续发展能力，同时也有力地促进现代化农业的进程。

5 展望

农业微生物始终贯穿着整个农业的生产过程。例如，获取农业微生物基因的抗逆育种、植物病原微生物流行与防治、微生物农药、土壤微生态环境调控治理、微生物肥料、污染退化环境微生物防治、微生物发酵食品、能源微生物等。其中，以种类、数量最多的细菌类农业微生物资源给农业生产带来的效应尤为显著。

农业微生物中功能性细菌作为一种新型资源，在减少化肥、降低环境污染、提高农作物品质、保护环境等方面具有重要意义。但在生产中的效果还不是很稳定，研究还不是很成熟，限制了它的进一步推广和普及。这是由于微生物菌剂的作用受许多条件的制约影响，如菌种的活性、发酵基质的选择、配比和发酵条件的不优化，限制了微生物菌剂中功能性细菌在农业及环境中的应用效果。因此对细菌发酵基质和发酵条件最优化还需根据特定情况进一步进行探讨研究。