CLCA1 的功能及在疾病中的作用研究进展

万胜君 柯昌斌

湖北医药学院附属太和医院麻醉科，湖北十堰 442000

1992 年，Ran 等[1]从牛气管中分离出第一个钙激活氯通道调节剂（calcium-activated chloride channel regulator,CLCA）蛋白，并预测这是一种对氯离子通道阻滞剂具有阴离子选择性和敏感性的通道蛋白。1995 年，Cunningham 等[2]在牛气管的上皮细胞中克隆出一个与Ran 等[1]发现类似的钙激活氯通道蛋白，将其命名为bCLCA1，这就是第一个CLCA 基因的发现。随后该基因家族成员的数量不断增长，到目前为止已在包括人、牛、小鼠、大鼠、猪、狗和马7 个物种中发现CLCA基因[3-4]。CLCA 家族的蛋白质最初被认为是允许氯离子通过细胞膜的通道，直到2005 年，Gibson 等[5]发现这些蛋白质通过激活钙依赖的氯通道（calcium-activated chloride channel，CaCC）来触发氯离子穿过细胞膜的运动。

人体基因组存在4 种CLCA 基因，分别是CLCA1、CLCA2、CLCA3 和CLCA4。CLCA1 是人体内该家族第一个被克隆和鉴定的基因。研究表明，CLCA1 蛋白参与了炎性气道疾病[6]、肠道疾病[7]和恶性肿瘤[8]等的发生和进展。充分了解CLCA1 蛋白的结构、表达分布以及其在相关疾病的作用机制，可为疾病的治疗提供有价值的参考。

1 CLCA1 的分子结构与分布

1.1 CLCA1 的分子结构

CLCA1 是定位于1 号染色体短臂（p22-p31）上具有14 个内含子和15 个外显子的长31 902 bp 的基因，其前端有一个包含L1 转座因子片段的典型启动子区域，编码相对分子质量约为125 kD 的前体蛋白[9]，这是一种约由900 个氨基酸组成的分泌自裂解蛋白。

1.2 CLCA1 的分布

CLCA1 蛋白在多种动物体内发现，在小鼠、大鼠、猪、猫、牛和马中鉴定和克隆了同源基因。CLCA1主要存在于正常的大肠、小肠和阑尾中，尤其在隐窝细胞中表达相对丰富，在病变的肺、胰腺、卵巢和健康的黏膜组织，如子宫、睾丸和肾脏也有一些表达[10-13]。

2 CLCA1 的分子特性

CLCA1 蛋白具有高度保守的蛋白结构域，对其进行纯化的蛋白质、肽和全面的功能分析，证明它是一种新型的锌金属蛋白酶，具有自我催化裂解功能。CLCA1 现唯一已知的底物是其自身，在胞内合成后经过自催化裂解使得两个裂解产物片段都分泌至胞外。CLCA1 的N 端信号序列引导蛋白质进入分泌途径，并进行自催化裂解，从而产生约90 kD 和38 kD的N 端和C 端片段[14]。其N 端产物包含3 个结构域，分别为锌依赖的金属蛋白酶催化结构域（CAT）、富含半胱氨酸结构域（Cys）、von Willebrand A 型结构域（vWA），C 端产物为Ⅲ型纤连蛋白结构域（FnⅢ）。N端产物CAT 内具有类似于基质金属蛋白酶和去整合素金属蛋白酶的保守HExxE 催化基序，vWA 内具有保守的金属离子依赖黏附位点。

3 CLCA1 的基本功能

CLCA1 的主要功能为激活CaCC，利用速率理论分析建立的模型证明CLCA1 通过降低离子在孔隙中转运的能垒从而提高CaCC 的电导，增加内源性钙依赖性氯离子电流的幅度[15]。对于CaCC 的激活，CLCA1的自催化裂解发挥不可或缺的作用，因为这种激活过程需要自裂解暴露包含CAT/Cys 和vWA 结构域的N端片段[16]。

4 CLCA1 的生理和病理作用

氯离子通道在生物体内广泛分布，相比于氯离子的运输，他们能更好地传导其他阴离子。氯离子通道在物质跨细胞上皮运输、细胞的增殖与分化、凋亡，乃至参与细胞免疫应答和细胞兴奋性调节等过程中都具有关键作用。因此，作为氯离子通道调节剂的CLCA1 在生物体内也具有十分重要的作用。

4.1 CLCA1 在呼吸系统中的作用

CLCA1 在呼吸道黏膜表面表达3 种CLCA 蛋白，但调节黏液蛋白基因表达和随之产生的黏液是CLCA1 特有的功能。CLCA1 由杯状细胞和其他产生黏蛋白的细胞选择性表达，通过启动丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，在体内表达黏液蛋白，从而刺激黏液产生，并分泌到气道黏液层[17]。

在维持气道环境稳态中，气道黏液通过发挥黏膜免疫和黏膜清除能力构成气道防御系统的一部分，梗阻性黏液产生的主要来源是黏液细胞化生（mucous cell metaplasia，MCM），即小气道上皮细胞分化为产生黏液的杯状细胞。MCM 是由炎症免疫细胞在应对过敏原、病原体等攻击时产生的白细胞介素-13（inter leukin-13，IL-13）、IL-4、IL-9等辅助性T细胞2（helper T cell 2，Th2）触发的。在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支气管哮喘等疾病中黏液分泌过度是一个主要的临床和病理特征，当机体遭受上述疾病时，气道内的杯状细胞群有扩大的趋势，即发生MCM。气道黏液的最关键成分之一是黏蛋白MUC5AC，这是一种凝胶形成的可溶性黏多糖组成的糖蛋白。

4.1.1 支气管哮喘 IL-9 在哮喘的气道重塑中发挥重要作用，其在哮喘患者气道上皮细胞中表达上调。IL-9对支气管上皮细胞有多种影响，包括肥大、转化为杯状细胞表型等。Th2 型超敏反应产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13 等细胞因子，其中IL-4、IL-13 与IL-9有一定的重叠作用，进一步推动哮喘的演变进程。

哮喘患者气道上皮CLCA1 mRNA 表达上调[18]。研究表明，CLCA1 上调的部分原因是IL-9，在IL-9 转基因动物的肺组织中CLCA1 表达显著增加，气管内注入IL-9 和Th2 细胞因子后CLCA1 的表达也明显增多[19]。如前所述，IL-9 在哮喘黏液分泌中起重要作用，用人原代肺上皮细胞培养系证实，IL-9 直接上调MUC5AC。而CLCA1 似乎与MUC5AC 的高分泌也有关。这两个基因都是在肿瘤坏死因子α 的刺激下，被诱导产生于气道黏膜组织中的[20]，将CLCA1 引入人肺黏液上皮样癌细胞（NCI-H292）可以诱导黏液的产生和MUC5AC 的表达[21]。但在另一项研究中，用siRNA转染介导敲除NCI-H292 细胞系中的CLCA1 基因表达未能降低MUC5AC mRNA 或蛋白质水平[22]，这两种相互矛盾的观点使得CLCA1 和MUC5AC 之间的联系更具探索性。另外，IL-13 也可通过驱动气道上皮细胞CLCA1 过表达激活涉及MAPK13 的信号级联，有效促进哮喘黏液分泌。总之，在哮喘气道重塑过程中CLCA1 通过IL-9、IL-13 等细胞因子启动一系列机制来参与MUC5AC 的表达和随之而来的黏液分泌。

4.1.2 囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）CF 在肺部通常表现为慢性梗阻性病变。它由囊性纤维化跨膜电导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变引起。CFTR 的突变会扰乱正常的氯离子转运，导致黏液盐分不足和水分不足。

CLCA1 和CFTR 的组织表达谱有重叠，表明这两个基因可能同时参与CF 的发病过程[23]。在CFTR 缺陷小鼠中发现的致命性肠道疾病可以通过上调CLCA1的表达来纠正。当CF 患者发生伴随强烈炎症反应的持续性气道表面感染时，支气管黏膜中IL-9 及其受体IL-9R 和CLCA1 的表达增加[6]，以类似于哮喘的方式，驱动修复气道上皮损伤的IL-9 杯状细胞增生通路。

4.1.3 COPD COPD 以杯状细胞增生和黏液过度分泌为特征。CLCA1 在COPD 患者气道内表达显著增加[24]。如前所述，CLCA1 通过启动MAPK 信号通路来表达黏液蛋白，在COPD 患者中这一通路高度激活，成为阻塞性黏液产生的主要来源。

4.2 CLCA1 在消化系统中的作用

肠道黏液通过润滑和限制上皮与寄生在肠道的细菌之间的接触来保护黏液层下面的上皮。黏蛋白2（mucins 2，MUC2）提供肠道黏液的结构骨架，MUC2分泌后可形成类似网状的片状结构堆积在一起，形成一种能够阻止细菌穿透的筛分黏液结构网。

在肠道分泌的黏液中，CLCA1 沿着肠轴具有类似于MUC2 的黏液结构表达模式，由于它的N 端裂解产物中含有一个具有金属离子依赖性黏附位点的vWA 结构域，CLCA1 可作为肠黏液中的一种内源性金属蛋白酶水解处理MUC2，成为肠黏液加工的关键调节因子之一。

4.2.1 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）UC 是由黏液结构破坏、肠上皮屏障功能持续失调引起的一种结肠黏膜炎症性疾病。UC 患者结肠上皮细胞培养发现CLCA1 表达显著下调[25]，CLCA1 表达的降低可能影响肠道黏液加工，破坏黏液屏障功能而导致UC 的发生。

4.2.2 囊性纤维性肠黏液病 在囊性纤维化患者中可观察到肠道黏液停滞梗阻。在CF 模型中，CLCA1 的转基因修复降低了其在小肠中的表达，改善了黏液阻塞的表型。另外，在囊性纤维化患者中，CLCA1 变异也与胎粪性肠梗阻有关[26]。

4.3 CLCA1 在癌症中的作用

人和动物体内的离子通道通过影响细胞体积、细胞内pH 值、信号分子的产生以及蛋白激酶和磷酸酶的活性而参与肿瘤发生发展进程。因此，在上皮细胞的离子传导过程中具有重要意义的CLCA 家族在肿瘤发生和转移中同样发挥着独特的作用。CLCA1 的转录还被证明与原癌基因c-myc 的转录持续相关[27]。

4.3.1 CLCA1 在结直肠癌中的作用 绝大多数结直肠癌患者是由控制β-连环蛋白降解的APC 基因失活突变造成的，这两个基因都参与Wnt/β-连环蛋白信号通路。Wnt 信号异常激活导致β-连环蛋白在细胞质中积累和核转位，这是癌细胞增殖转移的重要机制。

体外实验结果表明，CLCA1 表达上调可能抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程[28]，已知异常的Wnt 信号可以触发EMT 过程，这在癌症转移中也起着至关重要的作用。在EMT 过程中，上皮细胞转化为间充质细胞，失去细胞间的黏附性和细胞极性，获得迁移和侵袭性，揭示了CLCA1 能够调节Wnt/β-连环蛋白驱动的肠细胞自发分化的机制。CLCA1 可能参与控制结直肠上皮细胞的增殖与分化，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，从而在结直肠癌的发生和转移中起到抑制作用。

利用人肠癌细胞系（Caco-2）发现CLCA1 是肠癌细胞和肠道组织从增殖到分化的调节因子，CLCA1通过增强黏附分子E-cadherin 和肠碱性磷酸酶的表达促进肠上皮分化[29]。细胞从增殖到分化的转变可能是由包括E-cadherin 介导的细胞-细胞黏附在内的特定生化事件触发的。在结直肠癌中，E-cadherin 在高侵袭性低分化癌中的表达常被下调，因此通过上调CLCA1 来增加E-cadherin 的表达可能促进细胞分化，降低癌组织的恶性程度。

基于以上理论可推测，提高CLCA1 的表达在结直肠癌的发生转移和恶性程度的控制中起重要作用。CLCA1 在结直肠癌组织中的表达低于癌旁正常组织，血清和组织中CLCA1 水平与结直肠癌组织学分级、转移和肿瘤分期呈负相关。

4.3.2 CLCA1 在卵巢癌中的作用 卵巢癌的腹腔转移主要依靠多细胞聚集物（multicellular aggregates，MCAs），CLCA1 对细胞聚集有影响，其在MCAs 形成过程中显著升高，使用siRNA 敲除CLCA1 降低了癌细胞形成MCAs 的能力。蛋白质组学分析显示，CLCA1 在卵巢癌细胞系（OV-90）中表达增加[8]。

4.3.3 CLCA1 在胰腺癌中的作用 基于质谱的蛋白质组学发现，CLCA1 在胰腺癌中是一种潜在的肿瘤抑制因子，其表达水平与患者生存期呈负相关[30]。CLCA1在正常的胰腺中不表达，但它存在于超过一半的胰腺癌组织中[10]，并可分泌到胰腺囊肿液和血流中。因此，CLCA1 可作为胰腺癌的备选生物标志物。

4.4 CLCA1 与骨癌痛

骨癌痛是原发性骨肿瘤或晚期侵袭性肿瘤引起的一种严重的并发症。众所周知，脊髓背角是外周感觉信号整合和中枢痛觉超敏反应神经环路信号转导的关键部位。在前期的高通量基因测序工作中，检测到CLCA1 在小鼠骨癌痛模型中脊髓背角层面的表达下降约60%。据此，围绕CLCA1 是否参与骨癌痛的发生发展而展开的一系列工作正在进行中。

5 总结与展望

CLCA1 通过发挥金属蛋白酶及氯离子通道调节作用，参与调控上皮细胞内阴离子的传导从而影响黏液分泌、电解质转运、信号通路传导、细胞增殖与分化等生理及病理过程，而成为相关疾病的重要潜在靶点和标志物。然而，CLCA1 基因的发现到目前为止不过二十余年，关于它的研究仅局限在上述几类疾病中，在其他病理状态例如骨癌痛中CLCA1 是否发挥作用，尚待更深入和完善的研究。目前，针对CLCA1 而衍生的相关疾病治疗手段和临床药物正处于缺乏阶段。因此，面对这一空缺，在未来针对相关疾病的药物发掘和探索中，CLCA1 具备十分重要的研究价值。