登革病毒实验室检测方法研究进展

王倩，刘师文，龚甜

（江西省疾病预防控制中心, 江西 南昌330029）

登革病毒经伊蚊叮咬传播，可引起登革热，严重者还可引起登革出血热以及登革休克综合征。患有登革热的病人会主要会出现发热、皮疹、关节痛、颜面潮红、胸部发红出血、全身肌肉酸痛等症状，严重者会出现心肌损伤以及肾功能损伤，登革休克综合征是登革病毒感染最严重的临床表现，其主要症状为全身循环衰竭[1]，而在发病的早期这些症状表现为轻微并且与其他上呼吸道疾病有类似的临床症状[2-3]，易误诊。 人体对登革病毒普遍易感，首次感染后会产生特异性抗体并可维持多年，当再次感染其他型别登革病毒时， 会因为抗体依赖感染增强作用 （Antibody dependent enhancement，ADE） 出现更严重的症状并发展为重症登革热。 登革病毒的实验室快速检测对于及时诊断、减少重症病例的发生和登革热疫情的防控非常重要，本文阐述了登革病毒的实验室检测方法，对近年来登革病毒的检测技术进行综述。

一 登革病毒的结构与型别

登革病毒为单股正链RNA 病毒， 是黄病毒科、黄病毒属，基因组全长约11kb[4]。基因组由1 个开放阅读框（Open reading frame，ORF）和非编码区（5’UTR，3′UTR） 组成，ORF 可翻译和加工为三种结构蛋白和七种非结构蛋白， 分别为衣壳蛋白（C蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）和包膜蛋白（E 蛋白）以及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5。 E 蛋白主要起中和反应， 抗体交叉反应也由其引发；NS1 基因长约1056bp， 编码的NS1 蛋白是登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白， 该糖蛋白在登革病毒4 个分型中均具有较高的稳定性， 可在感染细胞的表面表达，并且可以分泌到细胞外[5]。NS3 和NS5 主要对基因组的复制和蛋白的加工起催化作用；NS2A、NS2B、NS4A 和NS4B 作为转膜蛋白，功能是将NS3 和NS5 转运到内质网囊泡上[6]。5′端的I 型帽子结构可以保护其免受酶降解，同时促进翻译；3′ 端无poly(A)尾结构，高度保守，可能与病毒复制相关[7-8]。 登革病毒与其他黄病毒(包括黄热病病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒等) 之间约有40%的氨基酸相似性[9]，这也是导致登革病毒与其他黄病毒检测中存在交叉反应的原因之一。 DENV 根据病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，分为4 个血清型（DENV1-4)，而同一血清型病毒之间往往还存在若干不同亚型，研究表明，同一血清型的不同亚型之间存在约3%的氨基酸水平差异和6%的核苷酸水平差异[10]，以DENV-1 为例，5 个亚型之间核苷酸相似性约为92%，5′UTR核苷酸序列完全相同，3′UTR 二级结构各不相同，可能影响病毒的致病性； 氨基酸序列相似性约为98%，5 个亚型蛋白中，NS2A 蛋白中的变化概率最高，可能影响病毒的复制能力[11]。

二 登革病毒的实验室检测

1 病毒分离

病毒分离培养是检测登革病毒感染的金标准[12]。目前用于培养登革病毒最主要的细胞为白纹伊蚊C6/36 细胞，其敏感性较高，典型病变特征为细胞呈空泡状[13]。 Richard G.Jarman 团队研究发现， 通过伊蚊胸内接种C6/36 细胞的阳性率为79.4%（1226/1544），高于直接接种于C6/36 细胞的阳性率的阳性率62.5%（966/1544）[14]。

标本采集的时间是登革病毒分离成功与否的重要因素。在感染的急性期（发病4 d 内）采集的样本分离率可达85%，而从发病第5 d 开始阳性率则减少为65%， 这是由于感染后5 d 左右开始产生抗体[14-15]。 使用原代单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)培养，也许可以改善抗体对某些黄病毒分离率的降低， 有学者在患者标本病毒分离前使用MDMs 预培养发现可以提高寨卡病毒从人血浆中分离率[16]，而登革病毒与寨卡病毒不仅有相似的传播媒介，也有着极为相似的结构，对于重点疫区未在发病急性期采样的登革热患者病毒分离率的提高可能有一定的提示。

虽然登革病毒可以通过其他的检测方法在患者的血液、尿液、唾液中检出，但目前在尿液和唾液中暂无成功分离出登革病毒的试验， 因此血清仍然是病毒分离的首选标本类型。 当使用血清接种细胞时，预稀释能够提高分离率[17-18]，可能由于血清稀释降低了血清对细胞的毒性作用的干扰。除了血清以外，全血、血浆和外周血淋巴细胞也成为了许多学者病毒分离的研究对象。 Klungthong Chonticha 等[19]使用病人全血和血清接种C6/36 细胞对比发现， 全血的病毒分离阳性率78.2%（18/23）高于血清分离阳性率43.4%（10/23）。H L Wang等[20]使用血清和血浆接种伪盾伊蚊AP-61 细胞发现，血浆的病毒分离阳性率为33.3%(14/42)，高于血清分离阳性率19.4%(14/72)，Robert McNair Scot团队[21]将332 例登革热病毒感染病例接种恒河猴肾细胞（LLC-MK2)，外周血淋巴细胞（PBLs）中阳性率为22.9%，高于血浆阳性率6.9%。 另外，Nai-Ming Cheng[22]在登革热患者呼吸道成功分离到4株登革病毒， 这提示呼吸道样本或许也可以用于登革病毒分离。

2 血清学检测

酶联免疫吸附试验（ELISA）和胶体金（ICT）法是目前登革病毒抗体和抗原最常用的血清学检测方法，而其他血清学检测方法如血凝抑制试验、补体结合实验等由于操作较复杂，应用较少。

2.1 抗体检测

2.1.1 IgM 检测 DENV IgM 一般在初次感染的第3 至5 天可以检出，目前最常使用的IgM 检测方法为酶联免疫吸附（ELISA）法和胶体金（ICT）法检测患者的血清标本。 J.V.PARRY 团队[23]使用ELISA方法对唾液标本进行IgM 与IgG 抗体检测， 阳性检出率为92%，Andries Anne-Claire[24]发现唾液中的IgM 和IgG 检测的灵敏度接近血浆样本。 一项研究发现患者发病第7 天在尿液检出IgM[25]。 Andries Anne-Claire 团队[24]发现，登革热轻症患者无法检测到IgM， 因为当肾小球滤过膜严重受损时,膜通透性增加,使IgM 这种分子量大的五聚体经尿液排出，尿液中IgM 才会增多。 研究发现，尿液中DENV IgM 呈阳性的患者似乎病情更为严重，尿液IgM 阳性和阴性的血尿素氮肌酐比值为14.6%与8.2%，住院率分别为62.0%与35.7%[26]。 这提示尿液DENV IgM 可能是临床早期严重程度的标志。因此，DENV IgM 检测优先选择血清作为标本类型，在无法采血的情况，也可用尿液或者唾液作为替代的标本类型。

2.1.2 IgG 检测 DENV IgG 抗体一般在初次感染后10 d，再次感染后3 d 出现，在第3 周左右达到高峰。 在一项登革病毒IgM 与IgG 抗体检测的试验中，原发性登革热感染患者IgM 水平升高而IgG检测不出来，而大多数继发性登革热患者(86%)的IgG 水平升高而IgM 检测不出来，推测IgG 检测可用于区分原发性和继发性DENV 感染[27]。 应用ELISA 法检测DENV 特异性IgM 和IgG 抗体，根据两者的相对水平即IgM/IgG 比值联合DENV RNA 来区分初次感染和二次感染是目前最方便、最常用的方法[28]。

2.1.3 IgA 检测 秦成峰[29]使用胶体金免疫层析法可在登革热患者发病2~13 d 于尿液中检出DENV IgA， 并且发现重症患者IgA 水平显著高于轻症患者，可作为临床监测病情发展的快速方法。 唾液中IgA、IgG 和IgM 的浓度约为每100 毫升19.4 mg、1.4 mg 和0.2 mg[23]，Grace Yap 等[30]用抗原捕获抗登革热IgA ELISA 技术（ACA-ELISA）检测登革热病人唾液， 发现在发热后的3 d 内阳性率为70%，在发热后3 至8 d 上升至90%以上（在继发病例中高达100%），灵敏度高于ELISA 法检测血清IgM，后者在登革热确诊患者发热后前3 d 的阳性率仅10%， 发热第6 天后才上升到90%左右。 虽然ACA-ELISA 检测唾液IgA 具有操作简单、快速、无侵入性、成本低的优点，但其与样本中继发性感染者的比例有很大关系。

2.2 NS1 抗原检测 DENV 非结构蛋白1 （NS1）是临床上公认的DENV 感染早期检测的生物标志物[31]。 研究表明，发展为重症登革热的患者更有可能出现NS1 抗原检测阳性， 尤其是在发病第5 天后，NS1 抗原也因此被定义为重症登革热的标志[32-33]。 目前诸多研究者将NS1 抗原的检测与其他方法对比，余清[34]采用ELISA 方法对25 例登革热患者进行NS1 抗原检测与IgM 联合IgG 抗体检测法进行对比， 发现NS1 抗原检测阳性率为96%（24/25） 高于IgM 联合IgG 抗体检测法的阳性率84%（21/25）；石亚玲[35]使用胶体金免疫层析（GICA）法检测NS1 抗原，发现其与PCR 检测的阳性符合率为89.87%， 优于GICA 法检测IgM、IgG 抗体对于PCR 检测的阳性符合率64.88%， 而使用NS1 抗原和IgM/IgG 抗体联合检测结果与PCR 结果最接近， 且特异性良好， 因此条件允许的情况下，多种方式结合能提高检出率。 有研究研制了一种无标记的化学抗性免疫传感器， 在模拟的人工唾液中无需标记抗体孵育10 min 就能检测到浓度低至1 ng/mL 的DENV NS1[36]，另一项研究中标记抗体后孵育2 h 检测到浓度低至0.5 ng/mL 的DENV NS1[24]。

3 分子生物学检测

3.1 反转录-聚合酶链式反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） RTPCR 通过使病毒RNA 逆转录为cDNA 再以此为模板扩增从而检测病毒基因组。 多项研究使用RT-PCR 方法对登革热患者的标本类型上进行比较，Chonticha Klungthong 团队[37]的研究中使用巢式PCR（nested RT-PCR）的方法，对比登革热患者全血、血浆与血清标本的阳性率，发现全血检出率是三者中最高的。 发病3 d 内，血清RT-PCR 检出率为100%，而尿液与唾液联合则能达到80%；发病后期，即发病6~16 d，尿液与唾液的联合检出率高于血清[24,38-40]。一项研究[41]发现纳米陷阱(NT)颗粒与某些亲和剂（如丙烯酸和活性红120）等的化学诱导结合可以增加8~16 倍的病毒基因组拷贝数，且实验在多种病毒（ZIKV、DENV 和CHIKV）混合的尿液样本中有良好的特异性， 但该研究目前还处于模型感染阶段， 需要在含有多种传染性虫媒病毒的临床样本中验证。

3.2 实时荧光定量PCR （Quantitative real-time PCR，qPCR） 实时荧光定量PCR 是指在PCR 反应体系中借助荧光信号来检测病毒基因组。 目前，实时荧光定量PCR 分为探针法和染料法， 具有很高的灵敏性和特异性，越来越被广泛使用。 常规的标本类型为血清， 在发病第2 天即可在血中检测到DENV RNA。 最早在发病第3 天能在尿液中检出DENV RNA，至第7 至8 天阳性率最高，为73.2%，最长能在发病第14 天检出[42]。 EssiM.Korhonen[43]发现， 在登革热症状出现后第7 至13 天， 尿液中DENV RNA 检出率(72%)高于血清(31%)和唾液(50%)，与邱爽[44]的分析结果一致。 这提示尿液中病毒阳性持续时间更长，尿液检测检出窗口更宽、无创、安全，可以作为一种实验室诊断方法的补充。

有研究者使用同种荧光PCR 试剂盒对比核酸提取方法， 同时使用同种核酸提取方对比不同荧光PCR 试剂盒， 结果为柱提法提取与自合成引物荧光PCR 的灵敏度最高[45]。 对于低病毒含量的样本，不同样本类型、核酸提取方法，不同试剂的选择可能直接影响病毒的检出。有研究建立了针对4种亚型登革病毒的一种相对成本更低， 最低检出限为4.88 copies/uL 的方法[46]，适用于登革病毒的快速检测与分型。

3.3 其他分子生物学方法

3.3.1 实时荧光逆转录重组酶介导核酸扩增技术（RT-RAA） 在重组酶介导核酸扩增技术的基础上.利用荧光染料释放光能的变化动态反映病毒量。 在39℃反应20 min，即可完成检测，特异性与DENV 四种不同血清型间以及其他黄病毒属病毒均无交叉反应， 检测的灵敏度为102copies/uL，试验的重复性好[47]。

3.3.2 聚合酶链式反应-连接酶检测技术(PCRLDR) 应用PCR-LDR 可实现DENV 1-4 血清型的多重检测和分型技术。 在C 基因和E 基因处设计了73 条PCR 引物进行PCR 反应后于一个多重LDR 中进行靶向反应， 所产生的荧光标记的连接产物在通用阵列上检测。 350 例急性期患者血清中，与实时荧光定量PCR 结果相比，灵敏度和特异性均在98%以上，具有快速、灵敏、特异、高通量的特点，可同时检测所有四种血清型DENV[48]。

3.3.3 逆转录重组酶聚合酶扩增-侧向流层析试纸条检测技术(RT-RPA-LFD) 借助重组酶聚合酶扩增技术，结合侧向流层析技术建立的检测方法，在40℃反应20 min， 即可完成检测， 能同时检测DENV1-4，检出限为10 copies/反应。 该检测方法可以直接肉眼读取结果，特异性强，但其缺点为成本较高[49]。

三 总结与展望

登革热为我国法定乙类传染病， 且尚无特效治疗药物及防治疫苗， 对于临床病例和流行病区的病例快速准确地实验室诊断在登革热疫情防控中显得尤为重要。 根据不同的场景，可以选择不同的检测方法，例如：海关等现场检测可以使用胶体金免疫层析法进行快速筛查， 实时荧光定量PCR方法进行确证； 而临床工作中， 则更倾向于使用DENV IgM/IgG 法联合荧光定量PCR 法来确诊病例。

目前， 登革病毒实验室检测的标本类型主要为血液标本。 而在尿液、唾液等样本中可检出登革病毒核酸和抗体为采血困难的婴幼儿以及重症患者采集无创样本提供了可能[44]，为研究易于推广的无创快速筛查登革病毒技术提供了方向。 2019 年全国发生大范围的登革热暴发疫情， 我国基层病毒性传染病实验室条件差、检测能力弱，因此，开发适合于我国农村、边远山区、海岛等基层医疗水平欠发达地区使用的检测登革病毒检测试剂是急需攻克的难题也是今后研究的目标。