CRISPR/Cas9系统在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展

马 静，张艳艳，贾新月，马 勋，王正荣，薄新文,

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，石河子 832000)

基因编辑技术是利用核酸内切酶作为“分子剪刀”，对DNA进行靶向切割产生DNA双链断裂(double strand breaks,DSB)，诱导体内细胞产生2种修复机制,即非同源末端重组修复(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组修复(homology directed repair,HDR)[1],从而实现基因靶向修饰。基因编辑因能高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展现出了巨大的潜力。

目前，在基因编辑发展过程中，巨型核酸酶(meganucleases,MNs)、锌指核酸酶(zinc finger endonucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)及CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)系统是最主要的4种编辑工具。MNs又叫大范围核酸酶，其可识别的位点序列较长，但识别效率较低；ZFNs是人工设计的含有锌指DNA结合结构域和核酸内切酶FokⅠ切割结构域的蛋白核酸内切酶，但核酸内切酶FokⅠ必须形成二聚体才能将双链DNA剪开；与ZFNs类似，TALENs也是由2个结构域——转录激活因子样效应物(TALEs)DNA结合结构域和核酸内切酶FokⅠ催化结构域融合而成的；由于ZFNs和TALENs的复杂性、难度大和成本高等原因，使得它们的使用受到了限制[2]。作为获得2020年诺贝尔化学奖的基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、成本低、修饰效率高等优点[3]，成为了一种广受欢迎的基因组靶向修饰技术，已成功应用于小鼠[4]、秀丽隐杆线虫[5-6]、斑马鱼[7]、果蝇[8]、拟南芥[9]、水稻[10]、酿酒酵母[11]等模式生物。

鉴于此，研究人员开始将CRISPR/Cas9系统应用于寄生虫基因组编辑，通过研究与虫体发育、毒力及与宿主相互作用等相关基因，从而达到开发新的药物靶点和疫苗的目的，现已成功运用于多种寄生虫的基因组编辑。CRISPR/Cas9系统的应用发展迅速，笔者就该系统在寄生虫基因组编辑中的研究进展进行综述，旨在为后续相关研究提供参考依据。

1 CRISPR/Cas系统的发现与分类

1.1 CRISPR/Cas系统的发现

1987年,Ishino等[12]在对磷酸盐代谢相关基因进行分析时，在大肠杆菌基因组中首次发现了一个不寻常的重复DNA序列，即一个29个核苷酸重复序列，但它们被不相关的、非重复的短间隔序列打断。随后在其他微生物中又有一些类似序列的报道，2000年,Mojica等[13]发现在所有原核生物中均有类似序列，直到2002年Jansen等[14]将此序列正式命名为“CRISPR”。为探究这些序列的起源，2005年,Mojica等[15]对67株细菌和古菌株的4 500条CRISPR序列进行测序后发现，CRISPR/Cas序列中的间隔序列来自外源的噬菌体、质粒等，同年Pourcel等[16]报道了鼠疫耶尔森菌中的CRISPR通过优先摄取噬菌体DNA获得了新的重复序列。2007年,Barrangou等[17]首次证实了CRISPR/Cas是一种细菌适应性免疫系统。作为一种适应性免疫系统，CRISPR/Cas系统如何进行自我与非自我识别，如何抵抗外来入侵核酸呢？Deveau等[18]通过对噬菌体基因组原间隔序列的分析发现了一个与原间隔序列直接相邻的短基序，称为原间隔子相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)，这种PAM基序对宿主进行自我与非自我识别非常重要[19]。Brouns等[20]研究发现，成熟的crRNA(CRISPR RNA)可作为小的引导RNA使Cas蛋白复合物能干扰病毒的增殖。2008年,Marraffini等[21]研究发现，CRISPR通过靶向DNA限制了葡萄球菌的水平基因转移，且可限制抗生素耐药性在致病细菌中的传播。2010年,Garneau等[22]发现，嗜热链球菌CRISPR1/Cas系统可特异性地切割质粒和噬菌体双链DNA。2011年,Sapranauskas等[23]研究表明，嗜热链球菌CRISPR3/Cas系统可转移到大肠杆菌中并提供异种保护，防止质粒转化和噬菌体感染。CRISPR/Cas系统不仅可特异性地切割，还可跨属转移，并对侵入性核酸提供异源干扰。由此可见，CRISPR/Cas系统的应用潜力有待进一步挖掘和研究。

2011年,Deltcheva等[24]发现，tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)介导crRNA的成熟对Cas9蛋白活性至关重要。2012年,Jinek等[25]在crRNA与tracrRNA形成双链结构的基础上通过将 crRNA的3′-端与tracrRNA的5′-端融合而生成嵌合RNA，即形成一个单链的向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)后成功在体外引导Cas9切割质粒，由此CRISPR技术开始转变为基因编辑工具。2013年,Cong等[26]利用CRISPR/Cas系统成功编辑哺乳动物基因组。

1.2 CRISPR/Cas系统的分类

CRISPR/Cas基因座编码古细菌和细菌的适应性免疫系统，由于其快速进化及研究逐渐深入，使得CRISPR/Cas系统的分类复杂化。基于2011和2015年的分类，Makarova等[27]在2020年又更新进化了CRISPR/Cas系统的分类。目前，CRISPR/Cas系统被分为2个类、6种类型、17个亚型。第1类(Class 1)包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3种类型；第2类(Class 2)包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ 3种类型，而每种类型又被分为多种亚型。

CRISPR介导的适应性免疫包括3个步骤：适应、表达和干扰[22]。在适应步骤中，来自入侵元素的外源DNA片段(称为原间隔子)被处理并作为新的间隔子合并到CRISPR阵列中[28]；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型系统中此步骤由Cas1、Cas2、Cas4等基因编码的关键酶负责，在Ⅳ、Ⅵ型系统中是Cas1、Cas2，而Ⅲ型系统在Cas1、Cas2的基础上多了1个逆转录酶[27]。表达步骤包括CRISPR阵列的转录，然后将pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)加工成成熟的crRNA，这些crRNA与1个或多个Cas蛋白组装成CRISPR核糖核蛋白(crRNP)复合物[28]；在大多数第1类系统中，Cas6是直接负责加工的酶，在Ⅱ型系统中，加工是由细菌RNaseⅢ(一种非Cas蛋白)催化的，而在许多Ⅴ型和所有的Ⅵ型系统中，大型效应Cas蛋白包含一个独特的催化中心负责加工[27]。干扰步骤包括crRNP复合物中的Cas核酸酶通过crRNA直接切割入侵的同源病毒或质粒核酸[28-29]；在第1类系统中，此步骤由多个Cas蛋白共同完成，即Cas3、Cas5、Cas8、Cas10和Cas11的不同组合，取决于类型和亚型。相比之下，在第2类系统中，此步骤由1个单一的大蛋白质——Cas9、Cas12或Cas13完成[27]。

2 CRISPR/Cas9系统在寄生虫基因组编辑中的应用

寄生虫作为一类具有致病性的低等真核生物，既可作为病原体，又可作为媒介传播其他疾病。当前寄生虫病的危害仍是普遍存在的公共卫生问题，寄生虫病对人类和动物健康都构成了严重威胁。通过基因组序列信息及其功能了解寄生虫与其宿主之间的关系，有助于开发新的诊断方法，也有助于开发新的药物和疫苗等。CRISPR/Cas9基因编辑技术为研究寄生虫基因功能提供了重要技术手段，该技术已成功运用于疟原虫(Plasmodium)、弓形虫(Toxoplasma)、隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、柔嫩艾美耳球虫(Emeriatenella)、利什曼原虫(Leishmania)、锥虫(Trypanosoma)、阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、犬新孢子虫(Neosporacaninum)、巴贝斯虫(Babesia)、血吸虫(Schistosoma)、蜱虫(tick)、蚊(mosquito)等。

2.1 疟原虫

2.1.1 恶性疟原虫 疟原虫属是通过蚊子传播的寄生虫，是引起疟疾的病原体。在5种人类感染的疟疾寄生虫中，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)是毒力最强、最致命的寄生虫，是造成高死亡率和发病率的主要病原。疟原虫属缺乏非同源末端重组所必需的机制[30]，因此，需使用同源模板来实现同源定向修复。Ghorbal等[31]使用CRISPR/Cas9技术产生了同时携带pL7-orc1和pUF1Cas9的寄生虫，全基因组测序证实了在内源性位点上存在所需的突变，即用丙氨酸替代Orc1亮氨酸137的突变，这种突变已被证实可影响1个编码恶性疟原虫主要毒力因子基因的表达。CRISPR/Cas9系统在恶性疟原虫上的首次成功应用证明了有效的基因编辑对于研究疟疾的巨大价值。

Wagner等[32]创建了应用T7启动子而非U6启动子驱动的双载体系统，还证实了sgRNA-T可在体外指导DNA模板的特异性切割，其构建的第1个质粒pT7 RNAP-HR可表达T7-RNA聚合酶，并递送DNA供体序列用于DSB修复；第2个质粒pCas9-sgRNA-T可表达Cas9和sgRNA到目标靶位点。随着该系统的应用，Wagner等[32]报道了转染后33 d编码天然球形相关富组氨酸蛋白的kharp基因缺失，且删除负责编码红细胞结合抗原175的eba-175基因后编辑效率在50%～100%之间。

虽然已在恶性疟原虫中开发了几种基于CRISPR/Cas9系统的方法，但仍存在脱靶突变和携带供体模板DNA的环状质粒与靶位点之间的意外重组。为此，Nishi等[33]对CRISPR/Cas9系统进行了改进，生成了内源性表达Cas9的寄生虫，通过转染仅含有线性DNA供体模板和sgRNA的质粒来改造基因，最终在既无脱靶突变也无意外重组的情况下，在2周内以>85%的高效率实现了定点诱变和荧光蛋白的融合。这种改进方式解决了恶性疟原虫CRISPR/Cas9系统目前的技术问题，将该系统在恶性疟原虫上的应用引入了一个新阶段。此外，Zhao等[34]还开发了一种生成Cas9i系统的整合策略，显著缩短了转基因恶性疟原虫的生成时间，且通过恶性疟原虫的单轮转染成功地实现了多重基因组编辑(突变或标记)。

2.1.2 约氏疟原虫 为建立Cas9蛋白在啮齿动物疟疾寄生虫——约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)中的内源性和组成性表达，Qian等[35]使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法将内源性基因sera1的编码区替换为完整的化脓性链球菌Cas9(SpyCas9)编码序列，成功产生了敲入Cas9的约氏疟原虫(PyCas9ki),得到的PyCas9ki虫体在整个生命周期中发育正常，并在环状体、滋养体和裂殖体阶段具有Cas9蛋白的表达。上述研究通过引入仅含有sgRNA和同源模板元件的质粒(pYCs)，成功地实现了PyCas9ki寄生虫基因组中不同内源性基因的缺失和标记修饰，且该PyCas9ki寄生虫为约氏疟原虫的基因功能研究提供了一个新的平台。

鉴于目前的研究方法可能受到可选择标记物的可用性和产生转基因寄生虫所需时间的限制，且随着外源序列的引入，还存在破坏天然基因调控元件的风险。Walker等[36]开发了一种基于化脓性链球菌Cas9，利用核酶-向导-核酶(ribozyme-guide-ribozyme，RGR)sgRNA表达策略和RNA聚合酶Ⅱ启动子的疟原虫基因编辑系统CRISPR-RGR。通过将该系统应用于约氏疟原虫，成功破环了编码PyALBA4 RNA结合蛋白的基因，并在pyalba4基因上插入了GFP标签。

Xu等[37]开发了一种基于微同源性介导的末端连接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)的CRISPR/Cas9(mCRISPR)策略，可有效地在具有重复序列的基因中同时产生多个突变寄生虫，并为研究虫体发育功能基因和疫苗研发提供了帮助。其在不使用模板DNA的情况下成功地在约氏疟原虫环子孢子表面蛋白(circumsporozoite surface protein，CSP)的中心重复区(central repeat region，CRR)产生了各种大小的突变体。突变后的寄生虫在蚊子体内阶段的发育存在严重缺陷，而在小鼠中与野生型约氏疟原虫17XL寄生虫相似，表明CSP-CRR在蚊子阶段的发育中发挥了重要作用。

2.2 弓形虫

在许多人兽共患寄生虫病中，弓形虫病是最重要的疾病之一，是由一种专性的细胞内寄生的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的，能感染包括人类在内的所有温血动物。操纵弓形虫基因组的能力可有助于发展有效的疫苗接种策略和更好的治疗方法。尽管有有效的反向遗传学系统，但同源整合并不是将外源DNA插入弓形虫基因组的首选机制。相反，DNA通过非同源端连接随机插入基因组。通过敲除关键成分KU80来失活非同源连接通路已被用于提高同源重组效率，从而促进弓形虫的基因敲除和标记内源性位点[38-39]。

Sidik等[40]使用RNA引导的Cas9内切酶在不需要选择的情况下有效产生敲除，并将点突变和表位标签引入弓形虫基因组，但由于缺乏可进行双链断裂修复的非同源连接机制，ΔKU80突变体比野生型弓形虫更易受到遗传的影响。进一步利用CRISPR/Cas9系统进行了刚地弓形虫全基因组基因评估，分析每个基因在人类成纤维细胞感染中的作用，并确定了一种称为类顶端复合体微粒蛋白(claudin-like apicomplexan microneme protein，CLAMP)的入侵因子[41]。

Shen等[42]使用CRISPR/Cas9来破坏Ⅰ型RH虫体的尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因，UPRT基因的丢失导致虫体对氟尿嘧啶脱氧核苷(FUDR)的耐药性，电穿孔48 h后对Ⅰ型RH虫株进行FUDR筛选和测序，成功产生了UPRT基因突变。此外，Shen等[42]还破坏了Ⅰ型GT1虫体的ROP18位点，并补充UPRT位点的缺失，发现ROP18基因是影响急性毒力的一个重要因素。

Zheng等[43]利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除来评价弓形虫亮氨酸氨基肽酶作为药物靶点的潜力，通过表型分析发现，敲除弓形虫亮氨酸氨基肽酶可抑制弓形虫入侵和复制；通过补充弓形虫亮氨酸氨基肽酶的同义替代等位基因，恢复了敲除寄生虫的生长和入侵能力；小鼠试验表明，敲除亮氨酸氨基肽酶在一定程度上降低了刚地弓形虫的致病性，但由于没有完全阻断寄生虫的发育、毒力或酶活性，其只能作为刚地弓形虫的辅助药物靶点使用。陈凯等[44]利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Ⅰ型RH虫株的MORN2基因敲除株,经体外噬斑试验和体内感染试验结果表明，MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力，证明MORN2基因在RH虫株中无表型功能。Zhang等[45]利用CRISPR-Cas9技术检测了CTrp26和CTrx1在Ⅰ型RH弓形虫中的基本生物学功能,结果表明，CTrp26和CTrx1均位于弓形虫速殖子的细胞质中，缺失这2种硫氧还蛋白(thioredoxins，Trxs)中的任何一种均不影响该寄生虫的细胞内复制、逸出过程、斑块形成、过氧化氢抗性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，且这2种Trxs在昆明小鼠中不作为RH弓形虫的毒力因子。

Chen等[46]对RH弓形虫进行了全基因组CRISPR/Cas9功能缺失筛选，鉴定出了几个新基因，选择其中5个基因(HP1～HP5基因)进行进一步功能鉴定结果显示，在RH弓形虫中，HP1基因的靶向缺失导致了对过氧化氢的显著敏感性，以及体外抗氧化能力、侵袭效率和增殖能力的下降；体内试验结果也显示，感染HP1-KO弓形虫的小鼠存活时间比感染野生型弓形虫的明显延长。由此表明HP1基因可能与弓形虫抗氧化损伤和毒性有关。

2.3 隐孢子虫

隐孢子虫是继轮状病毒后引起腹泻的重要病原体之一，该寄生虫约有3 950个基因，但由于其不能在体外长期培养，且缺乏有效的基因工具，目前还没有针对该寄生虫的有效疫苗，且只有一种已批准的药物[47-48]。

Vinayak等[47]建立了在人回盲肠癌细胞(human ileocecal adenocarcinoma cells，HCT-8)中培养隐孢子虫子孢子的瞬时转染，但子孢子在细胞中只进行一两轮复制便会死亡，并在此基础上将转染后的子孢子直接注入免疫缺陷小鼠的肠道内，构建了小鼠感染模型，解决了隐孢子虫不能在体外长期培养的难题。为了使转基因虫体能富集，其构建了Nluc报告基因和新霉素耐药标记物(Neo)之间的融合翻译，以集中观察转染虫体的小亚群。此外，其利用CRISPR/Cas9技术进行了DNA修复试验，发现当隐孢子虫与特定sgRNA共转染时荧光素酶活性恢复；而没有特定sgRNA时没有观察到这一变化。表明隐孢子虫缺乏非同源重组修复，需同源重组修复。

2.4 柔嫩艾美耳球虫

柔嫩艾美耳球虫是肠道疾病球虫病的病原体，是一种尖端复合体原生动物寄生虫，在家禽寄生虫疾病中尤为重要。基因组测序结果显示，柔嫩艾美耳球虫的生命周期由超过8 000个基因控制，这些基因控制着无性复制、两性分化、传播和毒性等高度协调的生命周期[49]。然而，由于缺乏系统分析基因功能的工具，大多数基因的功能仍不清楚。

Hu等[50]报道了CRISPR/Cas9基因编辑技术首次在柔嫩艾美耳球虫中应用于单基因水平的基因功能分析及对整个基因家族的系统功能分析，其利用一个构成型表达Cas9的转基因株系，证明了非同源端连接和引导同源重组介导的功能丧失。将该方法应用于EtGRA9基因定位的研究，发现该基因编码一种分泌蛋白，可能帮助子孢子释放，并可能在子孢子和裂殖子的入侵过程中发挥重要作用。利用该方法对ApiAp2转录因子基因家族进行系统破坏，发现该寄生虫表达的33个因子中有23个对虫体的发育和生存至关重要。这些发现将为未来对柔嫩艾美耳球虫发病机制和虫体发育相关基因功能研究奠定基础。Tang等[51]使用CRISPR/Cas9对柔嫩艾美耳球虫的子孢子进行编辑，成功地标记了内源性微素蛋白2(EtMic2)，证明了CRISPR/Cas9系统能有效地介导HDR的靶基因断裂和修复及柔嫩艾美耳球虫的内源性基因修饰。

2.5 利什曼原虫

杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)是致命的内脏利什曼病的病原体。为了解利什曼原虫的感染和发病机制，并确定控制利什曼病的新药物靶点，需更有效的方法来操纵这种寄生虫基因组。Zhang等[52]利用锤头型核酶和丁型肝炎病毒(HDV)核酶开发了一种提高基因靶向效率的双sgRNA表达载体，精确缺失了大小为3 kb的米替福新转运基因(LdMT)。此外还发现了CRISPR/Cas9在LdMT基因中引起的一个新的单点突变，导致LdMT的单一氨基酸从蛋氨酸变为苏氨酸(M381T)。该突变导致了对米替福新(miltefosine，MLF)的耐药性，这是唯一可用的口服抗利什曼原虫药物MLF的忧患所在。通过将博莱霉素耐药基因表达盒插入Cas9切割位点，成功敲除了非必需基因Ldbpk_241510.1(一个多药耐药蛋白样基因)，并使用相同的方法成功用GFP标记了LdMT蛋白的N-端部分(381个氨基酸)，表明CRISPR/Cas9系统可以破坏并精确标记内源性基因。

A2是一个多拷贝基因家族，是内脏利什曼原虫感染的重要毒力因子[53]。在杜氏利什曼原虫1SCL2D中至少有11个大小不同的A2基因拷贝[54]。Zhang等[55]通过靶向杜氏利什曼原虫LdMT和A2基因，对CRISPR/Cas9活性进行共同选择来提高A2基因缺失的效率，通过免疫印迹分析，该系统可完全删除A2基因，且CRISPR/Cas9共同靶向A2与LdMT基因显著减少了删除A2基因所需的时间。

在利什曼原虫前鞭毛体的表面，磷酸糖(PG)，如脂磷酸糖(LPG)、蛋白磷酸糖(PPG)、游离磷酸糖聚合物(PGs)和酸性磷酸酶(sAP)等，通过调节巨噬细胞信号和细胞内运输，促进利什曼原虫在宿主细胞内的入侵和生存[56]。磷酸糖的合成依赖于LPG2基因编码的高尔基GDP-甘露糖转运体，Jesus-Santos等[57]使用CRISPR/Cas9系统敲除利什曼原虫LPG2基因，将成功敲除LPG2基因的寄生虫感染人类中性粒细胞并共孵育3 h，与野生型寄生虫感染相比，中性粒细胞内寄生虫的负荷量降低了83%，表明LPG2基因的缺失会减少虫体对人类中性粒细胞的感染。

2.6 锥虫

克氏锥虫(Trypanosomacruzi)是恰加斯病的病原体，是一种能同时感染人类和其他动物的原生动物寄生虫。克氏锥虫是最不被了解的原生动物之一，是导致感染性心脏病的原因。克氏锥虫的遗传复杂性及有限的基因组工程技术导致了对该病原体的认识和研究相对缺乏[58-59]。

然而，Peng等[60]的发现改变了这种情况，其将CRISPR/Cas9系统应用于克氏锥虫的基因工程，快速有效地敲除了包括必需基因在内的多个内源性基因。同时还观察到，在没有模板的情况下，克氏锥虫中Cas9诱导的DSB的修复是通过不同大小缺失的微同源性介导的末端连接(MMEJ)引起的。当提供DNA修复模板时，CRISPR/Cas9可极大地促进所提供的模板和基因组中特定位置之间的同源重组，其效率比没有CRISPR/Cas9诱导的DSB高几个数量级。此外，Peng等[60]通过敲除1个由65个成员组成的酶基因家族(β-半乳糖呋喃糖基糖基转移酶家族)，导致在没有明显脱靶突变的情况下酶产物显著减少，证明CRISPR/Cas9具有显著的多路复用能力，同时发现Cas9可介导其自身编码序列的破坏，挽救稳定表达Cas9的寄生虫的生长缺陷。

CRISPR介导的编辑，除了将Cas9和sgRNA质粒转染进入生物体内，使其内源性表达发生编辑作用外，还可通过在体外生成Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物来实现。Soares等[61]将纯化的重组金黄色葡萄球菌Cas9蛋白(SaCas9)和体外转录单引导RNA(sgRNAs)在体外进行组装后，经电穿孔导入克氏锥虫的不同生命周期阶段内，对报告基因和内源性基因进行了高效的基因组编辑，首次将Cas9-sgRNA RNP复合物递送到克氏锥虫的上鞭毛体和锥鞭毛体内进行基因编辑，从而提供了一种简单、快速、无克隆和选择的方法来评估这些重要病原体的基因功能。

Lander等[62]使用CRISPR/Cas9系统以枯草芽孢杆菌的glmS基因编码的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶内源性标记克氏锥虫糖蛋白72(T.cruziglycoprotein 72，TcGP72)和液泡内质子焦磷酸酶(T.cruzivacuolar proton pyrophosphatase，TcVP1)。通过PCR和蛋白印迹分析证实了使用glmS核酶沉默内源性基因的表达。同时还发现在正常生长条件下，克氏锥虫能产生足够水平的内源性6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)来刺激glmS核酶活性，而不需要向培养基中添加葡萄糖胺。该研究为验证克氏锥虫潜在药物靶点提供了一种可行的方法。

2.7 阴道毛滴虫

性传播的阴道毛滴虫在全球范围内流行，但其发病机制尚不清楚。由于其复杂、重复的基因组和缺乏有效方法，使其遗传操作受到了阻碍。Janssen等[63]首次将CRISPR/Cas9系统应用于阴道毛滴虫，利用同源定向修复证明了Cas9-gRNA可定向修饰一个纳米荧光素酶报告基因，并成功敲除了阴道毛滴虫的2个内源性基因，即编码铁氧还蛋白1(ferredoxin-1,Fd-1)的fd-1基因和编码人类巨噬细胞迁移抑制因子(migration inhibitory factor，MIF)同源物的mif基因。

阴道毛滴虫通过附着在黏膜上皮细胞上定植于人类的泌尿生殖道，从而造成感染。Molgora等[64]报道了阴道毛滴虫一种表面蛋白——TVAG_157210(TvAD1)的鉴定，并描述了其在阴道毛滴虫黏附宿主中的作用，这是首次关于阴道毛滴虫表面蛋白与宿主糖胺聚糖相互作用以启动寄生虫黏附于宿主的报道。TvAD1通过与宿主糖胺聚糖(GAGs)中硫酸肝素(HS)的组成部分N-乙酰氨基葡萄糖结合而与宿主表面相互作用，利用CRISPR-Cas9系统产生了敲除(KO)TvAD1的寄生虫，结果发现，与野生型相比，TvAD1-KO寄生虫对宿主细胞的黏附性显著减少。通过在TvAD1-KO寄生虫中过表达TvAD1使表型恢复后，与TvAD1-KO寄生虫相比，其黏附性明显恢复。表明TvAD1在阴道毛滴虫黏附于宿主细胞中发挥重要作用。

2.8 犬新孢子虫

犬新孢子虫是一种专性细胞内寄生的原生动物病原体，与刚地弓形虫相似，但不感染人类[65-66]，其可寄生于宿主的所有有核细胞中，在入侵宿主后，犬新孢子虫的速殖子居住在一个特殊的膜性细胞器中，称为寄生液泡(parasitophorous vacuole，PV)。PV具有抵抗宿主细胞酸化和溶酶体酶水解的功能，从而防止宿主细胞清除外源性寄生虫。此外，液泡内网络(intravacuolar network，IVN)增强了寄生虫对宿主胞质内物质的摄取[67]。

Arranz-Solís等[68]首次利用CRISPR/Cas9系统对犬新孢子虫进行基因组编辑，成功敲除了Nc-1虫体中表达绿色荧光蛋白的gfp基因，并通过插入耐乙胺嘧啶盒有效破坏了分离型Nc-Spain7虫体中的NcGRA7基因。该技术在犬新孢子虫中的成功应用为该寄生虫的高效基因靶向修饰奠定了基础。

Yang等[69]利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统鉴定了一种新型的致密颗粒蛋白——犬新孢子虫颗粒蛋白17(NcGRA17)，生成了NcGRA17基因敲除虫体(ΔNcGRA17)和NcGRA17基因互补虫体(iΔNcGRA17)。试验结果发现，ΔNcGRA17形成的斑块较小，细胞内生长较慢，对小鼠的毒力丧失。此外，还观察到NcGRA17缺陷寄生虫的PV具有异常的形态，结果表明，NcGRA17作为一种致密的颗粒蛋白决定了PV的形态和致病性，而NcGRA17的α-螺旋可能是导致PV形态异常的原因。

Wang等[70]利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统获得了犬新孢子虫Nc-1的NcGRA7敲除虫体(ΔNcGRA7)和NcGRA7互补虫体(iΔNcGRA7)，并通过一系列试验研究其在小鼠先天免疫中的作用，结果表明，NcGRA7在调节小鼠免疫因子和免疫相关鸟苷三磷酸酶a6(immunity-related guanosine triphosphatase a6，IRGa6)在寄生液泡膜(parasitophorous vacuole membranes,PVM)上的聚集中起着重要作用，从而影响了犬新孢子虫的致病性。Zhao等[71]成功构建了ΔNcGRA6虫体，并验证了NcGRA6是一个关键的毒力因子，NcGRA6基因的破坏可减缓犬新孢子虫的增殖，降低其对宿主的致病性。Dong等[72]构建了ΔNcGRA2虫体，表明NcGRA2作为一种致密的颗粒蛋白，形成了PV的液泡内网络结构，通过减缓增殖来削弱犬新孢子虫的毒力。Yang等[73]构建了NcGRA23和NcGRA11(a-e)敲除寄生虫，经研究表明，NcGRA23或NcGRA11(a-e)的缺失并不影响犬新孢子虫的繁殖和毒力。

为了在犬新孢子虫中实现高效的同源重组，Mineo等[74]针对基因组参考虫体Nc-Liverpool (NcLiv)的Ku异源二聚体DNA修复机制，破坏了NHEJ酶Ku80，结果表明Ku80的缺失会导致其二聚体Ku70的不稳定和丢失，但能获得高效的基于CRISPR/Cas9的基因标记和敲除。通过选择3个基因(刚地弓形虫分泌蛋白GRA48的犬新孢子虫同源蛋白(NcGRA48,NCLIV_069360)、一种新的犬新孢子虫特异性蛋白NCLIV_066730和一种新的蛋白 NCLIV_049870)进行表位标记来比较CRISPR/Cas9介导的内源性基因的表位标记的效率。结果表明，Δku80寄生虫的标记效率从Ku80存在时的20%左右提高到95%，并将第一个被鉴定出来的特异性蛋白NCLIV_066730命名为犬新孢子虫特异性GRA蛋白1(NSG1)，而NCLIV_049870蛋白定位于寄生虫的细胞核。

2.9 巴贝斯虫

巴贝斯虫是一种只在红细胞中入侵和繁殖的蜱传寄生虫，对畜牧业、宠物动物和野生动物的健康有巨大的经济影响，可感染多种哺乳动物，被认为是仅次于锥虫的第二常见血液寄生虫。对药物和杀螨剂的耐药性以及缺乏有效的疫苗是控制巴贝斯虫病的主要障碍[75]。

Hakimi等[76]首次将CRISPR/Cas9系统应用于巴贝斯虫，成功进行了表位标记、点突变和缺失。SBP3在寄生虫感染的红细胞的细胞质中表达，并表现出特有的染色模式。利用CRISPR/Cas9系统在sbp3基因开放阅读框(ORF)的3′-端插入一个编码2-myc标签表位的序列，经PCR和IFAT检测，结果表明成功标记了sbp3基因。Tpx-1是一种细胞质抗氧化酶过氧化物还蛋白，在其催化位点上具有过氧化物Cys，可减少过氧化物底物[77-79]。Hakimi等[76]利用CRISPR/Cas9系统对tpx-1基因进行点突变，将过氧化物Cys(Cys49)转化为Ser，发现该突变对活性氮(RNS)敏感性的影响小于完全缺失Tpx-1 ORF的影响。表明除了过氧化物Cys外，还存在其他催化位点，可以与RNS反应和解毒。

2.10 血吸虫

曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)是寄生在人体的血吸虫之一。就发病率和死亡率而言，血吸虫病被认为是人类蠕虫病中最致命的一种。血吸虫卵在疾病的发病、致病和传播中起着核心作用[80]。

Ittiprasert等[81]首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向曼氏血吸虫的omega-1 (ω1)基因，成功产生了ω1转录本和核糖核酸酶的缺失，该基因编码的ω1核糖核酸酶对Th2极化和肉芽肿的形成至关重要。在巨噬细胞/T细胞共培养中，基因编辑的虫卵不能极化Th2细胞因子反应。尾静脉注射小鼠后，ω1突变虫卵周围的肺肉芽肿体积明显减少。该研究不仅在mRNA和蛋白水平上诱导了可检测到的敲除，还观察到了明确的表型变化，由此证明了基因编辑在血吸虫功能基因组学中的应用价值。

Sankaranarayanan等[82]使用CRISPR/Cas9在曼氏血吸虫中引入了第2个基因突变，即SULT-OR的体细胞突变。SULT-OR是曼氏血吸虫在寄生阶段表达的一种磺基转移酶，其突变导致了曼氏血吸虫对药物奥沙尼喹的耐药性。进一步比较了该方法在寄生虫的虫卵、母孢子囊和成虫这3个不同发育阶段的效率，结果显示，经CRISPR/Cas9处理的成虫中有0.3%～2.0%的序列显示了跨越Cas9切割位点的缺失，而孢子囊缺失率为0.1%～0.2%，但在虫卵中这种缺失极为罕见。在成虫和孢子囊中最常见的缺失是预测切割位点上游34 bp的缺失，但也观察到了长达3倍的罕见缺失，即从预测的Cas9切割位点延伸到上游102 bp。表明SULT-OR的编辑效率在成虫中最高，其次是孢子囊，而在虫卵中效率最低。

You等[83]报道了通过将CRISPR/Cas9与单链寡核苷酸(ssODNs)结合，电穿孔转染试验感染小鼠肝脏中提取的虫卵，成功编辑了曼氏血吸虫的乙酰胆碱酯酶(AChE)基因。目标区域下一代测序分析显示，CRISPR/Cas9在虫卵中诱导的主要修饰是通过同源定向修复产生的。此外，来自AChE编辑虫卵的可溶性虫卵抗原表现出明显的AChE活性降低，表明程序化的Cas9裂解突变了AChE基因。将编辑后的血吸虫卵注射到小鼠尾静脉，与注射未突变虫卵的对照组小鼠相比，注射基因编辑虫卵的小鼠的肺细胞和脾细胞中检测到涉及白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-10和IL-13的Th2型反应显著增强。当基因编辑虫卵注射到小鼠回肠浆膜下层时，虫卵在小肠引流的肠系膜淋巴结细胞中诱导Th2型反应，IL-4、IL-13和GATA结合因子3(GATA-binding factor 3,GATA3)水平升高。这些发现证实了CRISPR/Cas9介导的基因编辑在血吸虫功能基因组学中的潜力和实用性。

幼虫在中间寄主——光滑双脐螺(Biomphalariaglabrata)中的发育是曼氏血吸虫生命周期的一个必要的组成部分。对宿主防御机制的了解可能会加速阻断血吸虫病传播工具的发展。同种异体移植物炎症因子1(allograft infammatory factor 1,AIF)是一种保守的钙结合蛋白，通常在吞噬细胞和中性粒细胞中表达，是巨噬细胞活化的标志。Coelho等[84]电穿孔转染光滑双脐螺胚胎(Biomphalariaglabrataembryonic，Bge)细胞，成功产生了BgAIF基因的目标突变，且该突变通过非同源端连接修复。此外，与对照组细胞相比，基因编辑的Bge细胞与血吸虫孢子囊的黏附明显受阻，这为进一步研究宿主与血吸虫相互作用中的其他成分奠定了基础。

2.11 蜱虫

蜱虫是专性吸血的体外寄生虫，是人类、野生动物和家畜多种病原体的重要载体。黑腿蜱(black-legged tick，Ixodesscapularis)，属于硬蜱科(Ixodidae)，是一种自然疫源性疾病莱姆病的传播媒介。仅仅在美国，每年就有超过4万例莱姆病病例报告，而实际感染人数可能超过30万例[85]。蜱虫卵很特殊，其卵内高压，还具有坚硬的绒毛膜；此外，雌性蜱虫通过一种称为吉氏器(Gene’s organ)的特殊器官在卵上涂上一层坚硬的蜡层，使卵相互黏结在一起。这一系列因素使得通过胚胎注射对蜱虫进行基因编辑的技术难以实现。

Sharma等[86]首次成功在黑腿蜱中进行了CRISPR/Cas9基因编辑，其使用了2种方法对蜱虫进行基因编辑：一种方法是直接进行胚胎注射CRISPR/Cas9基因编辑系统，注射后卵的存活率大约只有10%；另一种方法为ReMOT控制(receptor-mediated ovary transduction of cargo,ReMOT Control)，被称为受体介导的卵巢转导，其将Cas9 RNP复合物直接从血腔传递到发育中的节肢动物生殖系，允许通过成虫注射而不是胚胎微注射产生靶向和遗传突变。首先通过显微手术切除雌性蜱虫的吉氏器，从而使得蜱虫产的卵不再被蜡层包裹，并用苯扎氯铵和氯化钠处理卵，以去除绒毛膜并使卵干燥以降低卵内压力，这样就更易向其注射CRISPR/Cas9基因编辑系统，注射后卵的存活率高达100%。该研究将为蜱虫生物学和蜱虫-病原体-宿主的研究开辟新的途径。

2.12 蚊

2.12.1 伊蚊 埃及伊蚊(Aedesaegypti)是基孔肯雅热、黄热病和登革热病毒的有效传播媒介，每年造成数亿人感染和5万多人死亡[87]。埃及伊蚊的基因突变已用TALENs、ZFNs和归巢内切酶建立起来，这需要DNA结合蛋白结构域的工程来提供基因组靶标序列的特异性，而这些蛋白很难设计。Dong等[88]在一个同时表达红色荧光蛋白(DsRed)和增强青色荧光蛋白(ECFP)的转基因蚊子系中，针对ECFP核苷酸序列进行破坏，当提供Cas9酶和2种靶向ECFP基因不同区域的sgRNAs作为体外转录的mRNA用于种系转化时，个体仍然表达DsRed，但不再表达ECFP。经PCR扩增、克隆和测序发现ECFP靶基因包含2～27个核苷酸。这些结果首次表明，CRISPR/Cas9介导的基因编辑可在埃及伊蚊中实现，为进一步研究该蚊种的功能基因组学提供了参考。为了产生稳定的生殖系突变，Kistler等[89]将CRISPR/Cas9试剂显微注射到胚前期胚胎(细胞化前由细胞核合胞体组成的胚胎)，为体细胞和生殖系细胞的细胞核提供基因组编辑试剂。其进一步研究了显微注射混合成分的编辑效率，证明了CRISPR/Cas9通过不同的修复机制产生不同类型突变的能力，并报告了几个基因组位点的稳定的种系突变。

2.12.2 按蚊 在约450种按蚊中约有60种被认为是人类疟疾的传播媒介，是重要的寄生虫病病原[90]。Dong等[91]建立了改良的疟疾传播媒介冈比亚按蚊(Anophelesgambiae) 的CRISPR/Cas9基因编辑程序，研究了纤维蛋白原相关蛋白1(FREP1)失活对蚊子对疟原虫的敏感性和对蚊子适应度的影响。FREP1基因敲除突变体发展成成蚊，在卵囊和子孢子阶段显示出对人类和啮齿动物疟疾寄生虫感染的明显抑制。然而，FREP1基因失活对蚊子适应度也产生了影响，包括显著降低吸血倾向、繁殖力和卵孵化率，化蛹时间延迟及吸血后寿命缩短。基于CRISPR/Cas9基因操纵蚊子(特别是按蚊)的胚胎注射方法是困难和低效的，Macias等[92]采用ReMOT控制(受体介导的卵巢转导)技术将Cas9核糖核蛋白复合物传递到成蚊卵巢，在不注射胚胎的情况下在疟疾传播媒介斯氏按蚊(Anophelesstephensi)中产生了靶向突变和可遗传突变。在按蚊中，ReMOT控制的基因编辑效率与标准胚胎注射一样高。ReMOT控制对按蚊的应用为缺乏胚胎注射设备或专业知识的疟疾实验室扩展了CRISPR/Cas9技术的应用，建立了针对不同种类蚊子的ReMOT控制的灵活性。

3 小 结

CRISPR/Cas9技术自2013年发展以来，已被应用于多种研究领域中，如通过基因的敲入与敲除、DNA单碱基突变对基因进行精准修饰，从而提高某些植物的产量与抗病性、构建动物疾病模型、治疗疾病等。然而，CRISPR/Cas9系统在寄生虫研究领域中仍有许多不足，主要有以下几个方面：①当前较为成功的研究案例大多来自原虫，且已在功能基因研究和疫苗研究方面取得进展，但其他多细胞寄生虫的基因组编辑研究进展较为缓慢，仅有血吸虫的研究报道，其原因可能是原虫是单细胞，且大多可进行实验室传代，易于操作，而多细胞寄生虫生活史复杂，在虫体发育过程中很难找到易于进行基因编辑的单细胞期；②与原虫基因编辑效率相比，多细胞寄生虫编辑效率较低，其原因可能是多细胞寄生虫发育周期复杂，不同发育阶段虫体组织结构变化大，不可控因素较多；③基因编辑的脱靶突变现象等问题。因此，需进一步优化技术方案，以尽快实现更多多细胞寄生虫的基因组编辑，进而加快基因功能解析、药物及疫苗研发的进程。

随着CRISPR/Cas系统的不断发展与改进，其可能在寄生虫基因组规模的功能注释中也发挥重要作用。在不久的将来，该技术可能被广泛应用于寄生虫转录组和蛋白质组的后续研究，可更好地理解基因组功能、表达和调控机制，为临床检测、早期诊断和疾病预防等方面的应用提供试验基础，从而有效防治寄生虫病，促进人类健康。