玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入在视神经损伤中的作用△

何雪俊 邢怡桥 杨 宁

中枢神经系统受损后，其神经元难以再生。视神经也属于中枢神经系统，近年来关于视神经损伤和修复的研究成为人们关注的焦点[1-2]。目前研究发现，视神经损伤后，玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入可一定程度地保护视网膜神经节细胞(RGCs)并促进视神经轴突再生[3-4]。本文就玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入在视神经损伤中的作用展开综述，以期为视神经受损后再生的基础研究提供方向，为视神经损伤的临床治疗提供依据。

1 神经受损后的病理改变

神经受损后随即出现一系列的病理改变，从最初轴突细胞骨架的机械断裂，到轴索运输中断、肿胀和蛋白水解等[5]。周围神经系统损伤后远端轴突迅速崩解，而后雪旺细胞快速去分化并与成纤维细胞共同分泌细胞因子促进免疫细胞的聚集，同时神经元胞体开始表达再生相关基因[6]。但是再生能力薄弱的中枢神经系统损伤后血脑屏障遭到破坏，加之白细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞入侵，引起炎症反应过度激活[7]，继而发生细胞凋亡，导致神经退行性病变和神经元功能丧失[8-10]。例如，中枢神经系统中M1型小胶质细胞具有与巨噬细胞相似的功能，可以产生促炎症细胞因子[11]。Horn等[12]研究证实，神经受损后巨噬细胞和小胶质细胞均会被激活，对断裂的神经轴突回缩产生明显的影响。

2 视神经再生的阻碍因素

2.1 RGCs损伤后大量死亡Fischer等[13]和Joachim等[14]研究发现，视神经钳夹后，caspase依赖性凋亡通路被激活，导致RGCs在两周内大量死亡。研究发现，大鼠视神经损伤后4～5 d RGCs的存活率基本不变，自第6天开始存活率下降了约20%，尚存活的RGCs表现出偏心核，损伤持续加重。至视神经钳夹后第14天，存活的RGCs所剩不足10%[15-16]。前期我们研究发现，小鼠视网膜中不同亚型的RGCs对同一种损伤的反应性差异很大[17]。同时，我们的研究结果证实，RGCs在视神经钳夹后第3天开始出现进行性减少，而视神经钳夹30 d后，存活的RGCs数量无显著变化[17]。大量研究证据表明，缺血、缺氧、炎症反应、去神经性营养不良以及缺血再灌注损伤均可导致RGCs的不可逆性死亡[18-20]。因此深入探讨RGCs死亡的机制和过程，最大限度地保护RGCs还需要我们付出很大的努力。

2.2 中枢神经系统固有的再生能力弱中枢神经系统发育过程复杂，且中枢神经系统损伤后周围环境中会出现大量的抑制性神经生长因子，这可能是由于中枢神经系统发育成熟后再生能力薄弱所致。在胚胎的神经系统发育过程中，轴突首先从神经元胞体发出，然后以“网络化生长”的方式向周围延伸，随着轴突不断伸长，末端连接到目标，从而顺利构建功能回路。由于动物在出生后和青春期阶段体型的增加，可能导致中枢神经系统“网络化生长”的距离比最初所要经过的距离要远[21]。此外，中枢神经系统受损部位周围存在的抑制轴突生长分子，如少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白、髓磷脂相关糖蛋白等，被认为是阻碍轴突再生的重要因素[22]，通过基因缺失或药理抑制去除这些分子的影响，依然不能使轴突进行长距离再生[23]。

2.3 神经生长因子的缺乏神经生长因子在神经系统的发育过程中发挥着关键作用，它对周围神经系统和中枢神经系统中神经细胞的生长、分化和存活具有重要的调节功能[24]。研究表明，神经生长因子与其受体，在外侧膝状体和视皮层以及视神经和视网膜中均广泛表达[25-26]。研究发现，通过套管-微型泵系统将神经生长因子注射到脑室内，具有调节视神经和视网膜发育和分化的作用，并可促进RGCs的存活和轴突再生[27-28]。同时，也有研究证实，RGCs中神经营养因子的缺失，可以导致RGCs凋亡并阻碍其再生[29]。因此，我们可以认为神经生长因子的缺乏是导致视神经难以再生的一个重要因素。

2.4 瘢痕组织的形成中枢神经系统损伤后，炎症反应发生并过度激活，伴随多种细胞信号通路活化，受损的中枢神经系统周围会形成两种类型的瘢痕组织，一类是由成纤维细胞形成的纤维化瘢痕，另一类是由活化的星形胶质细胞、小胶质细胞等形成的神经胶质瘢痕[7,30]。其中，星形胶质细胞会分泌一类以硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)为代表的蛋白聚糖分子[31]，CSPG由蛋白质核心和硫酸软骨素侧链组成[32]。生理情况下，中枢神经系统中的CSPG可以发挥神经突触抑制作用，通过抑制神经元进入不适当的区域从而指导轴突的生长方向[33]。研究表明，CSPG主要存在于中枢神经系统的瘢痕和周围神经系统的神经内膜和神经外膜区域，是神经系统受损后神经轴突生长的主要抑制剂[34-35]。除了CSPG外，蛋白信号素3也被发现具有延缓胶质瘢痕生长的作用[7]。我们可以认为，活化的胶质细胞发挥了吞噬并分解神经元碎片、释放某些递质和营养因子以及修复血脑屏障的功能，然而瘢痕组织的形成又能将受损部位与周围组织隔绝，即使轴突再生往往也难以跨越瘢痕组织。因此，视神经损伤后，胶质瘢痕的形成也是导致视神经再生障碍的重要因素[36-37]。

3 玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入对受损视神经的作用

3.1 雪旺细胞大多数哺乳动物周围神经系统遭到破坏后具备一定的自愈能力，其结构和功能往往可以得到很大程度的恢复和保存，周围神经系统的这一特性与周围神经的两种主要组成成分雪旺细胞和成纤维细胞密不可分。Li等[38]把从新生坐骨神经分离纯化的雪旺细胞和成纤维细胞移植入成年大鼠玻璃体内，发现这两类细胞均可在短期内降低RGCs的死亡率，在视神经损伤的一段时间内，玻璃体内移植大量的雪旺细胞后视盘周围RGCs存活率更高，轴突分支也更多。近期，Ahmed等[39]通过研究也证实，将含有雪旺细胞的坐骨神经移植物注入玻璃体内可显著促进RGCs的存活和视神经轴突再生，在联合视神经断端与坐骨神经移植物吻合后，这种保护作用更为明显。雪旺细胞可分泌脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子等多种神经营养因子；同时，雪旺细胞衍生因子可能调节了基质金属蛋白酶的产生，从而促进CSPG降解[40]，使瘢痕组织溶解，减轻视神经损伤后对轴突再生的抑制，这些都可能是雪旺细胞对受损视神经具有保护作用的潜在机制。

3.2 脂肪干细胞中枢神经系统损伤后干细胞移植的作用在多种疾病模型的研究中都得到了肯定[41]。金海等[42]将由大鼠脂肪组织中获取的脂肪干细胞注入视神经钳夹后的大鼠玻璃体内，观察到自神经损伤第7天开始，玻璃体内移植脂肪干细胞的大鼠RGCs密度较同时间点对照组高。并且随着时间延长，虽然RGCs依旧减少，但实验组RGCs存活的优势更加明显；同时，在距离视神经损伤相同的位置，移植了脂肪干细胞的大鼠轴突数均明显多于对照组。由此可见，脂肪干细胞移植能促进视神经损伤后RGCs的存活和轴突的再生。Di Summa等[3]的研究也发现，脂肪干细胞可显著减轻神经损伤后纤维化组织的形成，在预防瘢痕组织的形成方面具有巨大的潜力，这为脂肪干细胞促进RGCs存活和轴突再生提供了依据。

3.3 间充质干细胞间充质干细胞可以从骨髓和其他组织(例如脂肪组织、神经组织、脐带血和真皮)获取。研究发现，间充质干细胞在视神经钳夹模型中具有较好的治疗效果[43]。将骨髓来源间充质干细胞注入到大鼠玻璃体内，发现它对视神经损伤后的RGCs有保护作用，并能刺激轴突再生[44-45]。Mead等[46]也发现，牙髓来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞均可促进RGCs存活和轴突再生，这两种细胞在进入玻璃体后，神经生长因子、脑源性神经营养因子等分泌都增加，植入牙髓来源间充质干细胞的大鼠神经生长因子滴度更高，其对损伤的视神经的保护作用和促进轴突再生能力也相对更强。此外，Chung等[47]研究也证实，人绒毛膜板源性间充质干细胞在大鼠视神经挤压伤后也可促进轴突存活。神经生长因子与生长相关蛋白在间充质干细胞移植入玻璃体后水平升高[46]，极有可能是间充质干细胞发挥视神经保护作用的主要机制之一。基于此，我们认为，间充质干细胞在视神经受损时对RGCs及轴突有一定保护和促进再生作用。

3.4 骨髓间充质干细胞来源的外泌体在证实骨髓间充质干细胞对受损的视神经有积极的保护作用后，人们进一步实验发现，将由骨髓来源的间充质干细胞分泌而来的外泌体注入视神经钳夹后的大鼠玻璃体内，结果发现，RGCs存活率、RGCs功能、视网膜厚度、轴突再生长度均高于对照组[4]。将骨髓间充质干细胞来源的外泌体注入玻璃体内避免了将活细胞移植入玻璃体中可能出现的免疫排斥反应，同时减轻炎症反应的发生；不仅如此，作为骨髓间充质干细胞发挥视神经保护作用的潜在机制之一，外泌体的神经保护作用也更为直接和高效。

4 讨论及展望

综上所述，现在已经发现多种细胞移植物或其衍生物具有促进RGCs存活和轴突再生的作用。本文主要对雪旺细胞和几种间充质干细胞的视神经保护作用进行了探讨。目前，尚无有效证据表明再生的轴突已建立了有效的联系，视神经作为中枢神经系统的组成部分，受损后如何重新建立解剖结构再生和功能修复的问题，是亟待解决的难点。因此，探索视神经病变后RGCs死亡和轴突再生的相关机制，提高RGCs存活及其轴突再生的概率并有效应用于临床对于医学和科研工作者而言，任重而道远。

诚然，某些玻璃体内细胞移植或细胞衍生物注入在视神经保护方面有着非常巨大的潜力，其中还有许多问题值得思考和解决：(1)移植的细胞进入玻璃体后是否能够存活，存活时间可以持续多久？(2)进入玻璃体的细胞是直接发挥其视神经保护作用还是分化为其他类型的细胞后发挥作用？(3)进入玻璃体的细胞是直接产生作用还是通过分泌某些细胞因子继而通过下游信号通路发挥作用？(4)视神经损伤往往具有不可预测性，如何把握进行治疗干预的时机？目前的研究表明，部分移植的细胞在进入玻璃体后神经生长因子的滴度会有所增加，在其分泌的细胞因子的调节下，瘢痕组织的形成会受到抑制，细胞来源的衍生物在神经保护方面也具有明显的优势。这些都为我们探寻视神经损伤后再生的阻碍因素，以及后续开展针对性的治疗提供了思路。