眼内液检测在眼部感染性疾病诊断与评估中的应用△

郝昕蕾 金 玮 王文俊 齐 奇 杨安怀

眼部感染性疾病是世界范围内致盲性眼病的最重要原因。然而，病原体的多样性给眼部感染性疾病的病因诊断带来挑战[1-2]。目前，临床中病原体培养技术阳性检出率低，且分子诊断技术仅能针对部分已明确的病原体[2-3]。为确定眼内微生物感染的种类，提高病原体检出率，需要更灵敏、无偏倚、全面的诊断技术。随着宏基因组测序(mNGS)技术和微量样本技术的发展[4-5]，眼科微量样本可提供核酸、抗体、细胞、细胞因子等多项信息[6-9]，这使得眼内液的临床诊断价值大大升高[4-10]。本文就眼内液检测在眼部感染性疾病中的应用进行综述。

1 病原学检测

病原微生物的检测方法多种多样，从传统的病原体培养到分子诊断技术，如PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、多重固相条带PCR(strip PCR)、环介导恒温扩增等，以及当下最火的高通量测序技术[1-2,11-13]，其间经历了不断革新。

1.1 病原体培养传统病原体培养技术阳性检出率低，不同文献报道的阳性检出率不同，基本在40%～70%[1-2,14-15]。有文献报道，玻璃体液病原体培养阳性检出率高于房水[1,16]，但在继发于角膜感染的眼内炎患者中，房水受累明显，阳性检出率高于玻璃体液[1]。病原体培养仅适用于部分微生物，如细菌和真菌，耗费时间长，在临床应用中明显受限[3,16]。与其他检测方法相比，病原体培养技术的优点在于其可以进行药敏试验[17]，对于调整临床用药具有指导意义。

1.2 分子诊断技术PCR作为最早使用的分子诊断技术，是大多数DNA检测手段的基石[14]。RT-PCR能够定量分析病原微生物，区分真实感染和外源性污染，并可预测预后[16]。16S PCR以一组能识别所有细菌中均存在的保守16S核糖体DNA作为引物，明确细菌的存在[15,18]。研究发现，相比于传统的培养手段，16S PCR具有较高的灵敏度和特异度[15,17]；灵敏度过高可能造成假阳性，可检出的微生物仅限于细菌，对真菌、病毒等无效，临床应用受限[15]。类似地，利用核糖体18S/28S DNA序列能确证真菌的存在[1]。strip PCR将多种病原体组成固定组合，可同时检测多种病原微生物。有研究表明，与RT-PCR相比，strip PCR具有更高的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，这两种方法的检测结果与临床诊断结果具有较高的一致性[12,19]。strip PCR操作简单，需要更少的样本、时间以及金钱。但strip PCR属于半定量检测，无法像RT-PCR一样提供具体数值；由于DNA扩增干扰，如果某一病原体拷贝数较高，会影响其他病原体的检出[12]。环介导恒温扩增是由Notomi等[20]首先提出的核酸扩增技术，该技术避免了DNA模板初始的热变性阶段和扩增中反复升降温步骤，操作简单，耗时短，但引物设计难度大，污染导致的假阳性会限制该技术的使用[21]。

1.3 mNGS近年来，mNGS发展迅速，美国FDA在2016年发布了二代测序体外诊断的指南草案，指出mNGS不仅可以鉴定病原微生物，也能检出基因突变和耐药基因等。在2020年初爆发的新型冠状病毒疫情防控中，mNGS也发挥了重要作用。近期我国学者发布多篇有关mNGS的专家共识[22-23]。mNGS是对一代测序即Sanger测序技术的革命性变革，无需克隆即可在一次运行中生成和检测数百万个核酸序列，利用mNGS高通量特性，可以获取标本中人源核酸序列和外源性病原微生物核酸序列信息，与人类和病原微生物基因组序列库对比，能够鉴定出病原体[2-3,10,24]。二代测序平台众多[3,24]，不同平台检测流程类似：样本的提取、运输与处理，提取核酸与建立文库，自动测序，质量控制与生物信息学分析，结果解读与报告出具[24-25]。mNGS是一种无偏倚、无假设的病原体鉴定技术，可以获得有关物种、血清型、毒力特性和抗生素耐药性、疾病暴发等信息，具有快速、覆盖度广等特点[8,10,22-26]。mNGS作为一种新技术，尚缺乏结果解读统一标准，在数据解释方面仍需进一步探索和规范[22,25,27]。操作中任何污染导致的假阳性都会使结果分析变得复杂，检测成本增高，限制了mNGS的临床应用[24-25,28]。

研究证实，mNGS在眼部感染性疾病中能够同时检出两种以上病原体和未知致病微生物[15,29-30]。Lee等[15]利用mNGS检测所有细菌培养阴性和部分培养阳性的眼内炎患者标本时发现了Torque Teno病毒，并被RT-PCR所证实。在一项临床研究中，印度学者检测了34例眼内炎患者标本发现，病原体培养阳性15例，mNGS检出阳性30例，他们认为mNGS是感染性眼内炎有价值的检测手段[8]。Gonzales等[31]利用mNGS检测眼部淋巴瘤患者标本发现了合并HHV-4和HHV-8感染的病例。

1.4 抗体和Goldmann-Witmer系数/Witmer-Desmonts系数在诊断感染性眼病中，我们还需关注Goldmann-Witmer系数(GWC)或Witmer-Desmonts系数(WDC)的作用[13,32-33]。这些参数主要用于区别特异性抗体是眼内原位产生还是血-眼屏障破坏渗漏导致的假阳性[4,34]。数值越高，越支持病原体IgG在眼内原位产生，反之则支持渗漏所致[4,35]。这些参数使用的前提条件是眼内液中病原体IgG为阳性[34]。计算公式如下：GWC=(眼内液某种特定IgG浓度/血清某种特定IgG浓度)/(眼内总IgG浓度/血清总IgG浓度)[35]；WDC=(眼内液某种特定IgG浓度/血清某种特定IgG浓度)/(眼内总白蛋白浓度/血清总白蛋白浓度)[13]。

以往研究报道，血清特异性IgG、IgE、嗜酸性粒细胞等对眼弓蛔虫病的检出率较低[36]。引入GWC后，在72例临床诊断为眼弓蛔虫病的病例中60例(60/72，83.33%)患者眼内液样本的GWC为阳性，检出率明显升高，眼内非特异性IgE还可以作为GWC的补充指标[35]；该研究还指出，虽然玻璃体液GWC阳性率(80.00%)稍高于房水(78.85%)，但差异并无统计学意义。GWC不仅可以检出眼内寄生虫，也可检出病毒。Wang等[13]采集31例前葡萄膜炎并发继发性青光眼患者的房水，发现WDC联合抗体检出了19例常见病毒感染，敏感性较高。Kang等[7]对32例病毒相关的Fuchs葡萄膜炎综合征(FUS)患者房水进行分析，证实所有患者眼内液中相应病毒的IgG抗体和GWC均为阳性，无关病毒GWC为阴性。

1.5 细胞正常情况下，房水中不含细胞成分，成年人玻璃体除皮质层含有少量细胞外，基本不含细胞。当眼部发生炎症反应时，眼内液中出现不同种类的细胞浸润，借助流式细胞术等细胞检测技术，可以得到眼内液细胞谱[37]，推测眼部感染可能的病原体种类。

研究发现，前房炎症反应的临床评分与房水中细胞计数之间存在相关性，而玻璃体混浊程度与玻璃体液细胞数之间并无相关关系[37-38]。他们推测后者出现的原因是玻璃体混浊的严重程度与玻璃体液中细胞数和蛋白浓度均相关[37]。急性视网膜坏死患者玻璃体液中CD4+和CD8+T淋巴细胞数较高[39]。细菌性或真菌性眼内炎患者的眼内液中，中性粒细胞数远多于其他细胞，其他类型葡萄膜炎患者中T细胞升高明显,不同细胞谱可作为不同种类病原体的线索指标[37]。Carreo等[37]检测了31份眼内液样本，发现在14份玻璃体液样本中，感染性葡萄膜炎患者的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值高于非感染性眼病患者，而17份房水样本未发现该规律。上述结论与一项多中心前瞻性研究结果相矛盾，后者发现眼结节病患者CD4+/CD8+T淋巴细胞比值和CD4+T淋巴细胞数显著高于眼部病毒感染患者，病毒感染患者的CD8+T淋巴细胞数高于眼结节病患者[39]。

2 细胞因子

细胞因子是一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质，能介导细胞间相互作用，分为白细胞介素(IL)、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、生长因子等。在眼部感染性疾病中，细胞因子能帮助我们评估眼内炎性环境，提示治疗终点和预测预后等。

2.1 评估眼内炎性环境眼部感染发生炎症反应时，眼内液中与炎症相关的细胞因子明显增加，利用这一特性，可以对眼部炎性环境进行评估。有学者对32例风疹病毒和巨细胞病毒相关FUS患者的房水细胞因子进行分析发现，与单纯白内障患者相比，FUS患者房水中IL-6、IL-8、IL-10、血管细胞黏附分子等细胞因子含量显著高于对照组，与前房炎症反应程度具有一致性[7]。Wang等[6]对38例眼弓蛔虫病患者眼内液进行检测发现，炎症细胞因子,如IL-6、IL-8、IL-10、血管细胞黏附分子和VEGF含量高于健康眼。感染性眼病患者眼内液中细胞因子含量不仅高于正常对照组，与非感染性疾病相比亦有差别。研究发现，眼内炎患者眼内液中IL-6含量高于非感染性葡萄膜炎和淋巴瘤[40]。此外，在巨细胞病毒性视网膜炎(CMVR)患者房水中CMV-DNA浓度与IL-6、IL-8两种细胞因子含量显著相关，玻璃体内注射抗病毒药物后，CMV-DNA载量、IL-8、IL-10含量显著下降，以IL-8降低最为明显[41]。

2.2 提示治疗终点与预测预后对于病毒性视网膜炎或眼内炎患者，局部治疗多采用玻璃体内注药，何时停止注药目前尚无共识。已有研究证实，细胞因子IL-8对骨髓造血干细胞移植术后发生CMVR患者的治疗终点有提示作用。有学者对24例造血干细胞移植术后CMVR患者进行前瞻性随机对照研究，根据治疗终点不同分为两组，证实以房水CMV-DNA<1×106copies·L-1或IL-8<30×103pg·L-1为治疗终点安全且有效，能减少球内注药次数[42]。另有研究结果表明，在HIV阴性的CMVR患者中，尽管停止治疗时CMV-DNA为阳性，但以IL-8<30×103pg·L-1作为治疗终点的患者无一复发，而所有复发患者均是以每升CMV-DNA<1×106copies·L-1为评估指标[43]。

细胞因子对眼部感染性疾病预后亦有提示作用。在CMVR的治疗过程中，IL-8降低是CMVR恢复良好的实验室定量指标[41,43]；此外，Wang等[6]发现眼弓蛔虫病患者前房炎症反应越严重，复发的可能性越高。

3 未来与展望

3.1 病原体耐药性研究发现，mNGS不仅可以检出病原微生物，还可以提供物种进化追踪。菌株鉴定及预测耐药性所需的基因组信息[23-25]。研究人员已证实，广谱β-内酰胺酶基因的检测与培养菌株的敏感性相关，表明mNGS可提供病原菌耐药性信息[24]。国外学者对感染CMV的5份样本进行mNGS，发现3份样本具有更昔洛韦和缬更昔洛韦耐药性基因突变[11]，提示眼内液检测可帮助我们了解病原体耐药性或毒力表型。

3.2 疾病模型IL-10/IL-6含量比值大于1提示眼内淋巴瘤，该指标为诊断淋巴瘤的重要参考[33]。在非感染性葡萄膜炎中，细胞因子种类及含量各不相同。Behcet葡萄膜炎患者房水IL-10显著低于FUS患者，而后者房水VEGF含量高[44]；小柳原田综合征和Behcet葡萄膜炎患者房水细胞因子种类亦有差别。据此可建立不同疾病模型[9]。细胞因子在靶向治疗方面亦有应用，在TNF-α处于正常范围的眼病中，抗TNF-α药物，如英夫利西单抗治疗无效；而在VEGF水平升高的眼病中使用抗VEGF治疗有效，证明靶向治疗的科学性[45-46]。与非感染性疾病类似，在眼部感染性疾病中，结合眼内液中抗体、细胞种类和细胞因子等信息可建立感染性眼病的疾病模型，以区别不同种类病原微生物感染，给予针对性治疗。