大河乌猪STARD3基因的分子鉴定、组织表达、多态性分析与相关研究进展

李昌武，刘永刚，万长华，廖 柱

（1.海南罗牛山畜牧有限公司，海南 海口 570100；2.云南农业大学，云南 昆明 650000）

猪的解剖结构与生理特点以及一些主要的生理生化指标都与人类相似[1]，是研究人类脂代谢相关疾病优良的模型动物。魏静元[2]成功获得5只高脂血症模型，研究ApoCШ基因对高脂血症发生的影响，结果发现ApoCШ基因能够显著影响血浆中的甘油三酯水平以及血浆中的脂蛋白脂肪酶活性，为人类利用ApoCШ基因治疗高脂血症提供了依据。同时在我国畜牧生产中，猪养殖生产所占地位众所周知，猪脂代谢研究对我国商品猪生产也同样具有重要意义。20世纪70年代以来，农户纷纷弃养我国本地猪种，引进国外肥肉少、瘦肉多的瘦肉型猪的猪种，在追求高瘦肉率目标的同时，直接导致了猪肉脂肪含量的变化，尤其是肌内脂肪（IMF, Intramuscular Fat）含量的下降，很大程度上影响了猪肉的多汁性、色泽、风味、嫩度和持水力，使猪肉品质的相关问题日趋突出[3]。我国地方品种小型猪的特色在于不仅肌内脂肪含量高，肉质也相对鲜嫩[4]，是与其它猪种进行肉质改良、使肌内脂肪含量增加以及我国猪自身遗传改良、保持高肌内脂肪的同时增加瘦肉率等重要的种质资源。大河猪原产于我国云南省曲靖市富源县大河镇，与杜洛克通过杂交反复选育后培育出大河乌猪，具有生产性能好、耐粗饲、瘦肉率适中、肉质鲜嫩、抗逆性强等特点。以大河乌猪作为母本与英系大约克夏杂交生产的肉猪170日龄体重达90 kg，耗料指数3.2，90 kg体重屠宰后腿比例30%，眼肌面积32 cm2，瘦肉率57%，肌内脂肪含量4%，是一种优质品种[5]。大河乌猪脂代谢相关功能研究无论对于改良猪的遗传性状亦或作为模型动物构建人类疾病模型来讲都具有重要研究价值与意义。

STARD3（又称MLN64）是一种迟发性内质体胆固醇结合膜蛋白，参与了胆固醇从内质体膜到质膜和（或）线粒体的转运、毒素诱导的抵抗和线粒体功能障碍。有研究表明，STARD3的过度表达会增加肝脏中的胆固醇含量并致使肝脏损伤，从而导致线粒体GSH（Glutathione，谷胱甘肽）含量下降，且会增加线粒体内胆固醇的含量，引发线粒体功能障碍[6]。Alpy等[7]通过诱变和缺失试验表明，STARD3在晚期内小体的表面也起到作用，在内小体中它可能限制胆固醇从限制膜运送到细胞质受体。Mercedes等[8]用抗STARD3抗体进行孕酮测定和Western blot（蛋白质印迹法），结果表明线粒体蛋白酶将STARD3切割成28 kDa的片段，刺激了合胞滋养层线粒体孕酮的合成，蛋白酶抑制剂减少STARD3转化和类固醇生成。STARD3目前已经被证明是一种胆固醇转运蛋白，它作为内质网-内小体接触的支架，通过向内小体输送胆固醇来调节细胞内胆固醇的重新分配[9]。

过度表达STARD3，会导致胆固醇外流增加并可防止胆固醇酯化增加，细胞内氧化LDL（低密度脂蛋白）积累减少，阻断胆固醇酯沉积，抗氧化能力增加。数据表明，STARD3通过促进细胞内胆固醇的去除和减缓疾病进展，成为AMD（年龄相关性黄斑变性）的潜在靶标[10-11]。且STARD3在晚期内体膜中定义了离散的含胆固醇亚结构域，并指出其可能在胆固醇转运中起作用[12]。这些结果都为STARD3的后续研究提供了新的方向。

1 研究的目的与意义

猪脂代谢基因与猪肉生产以及人类医学密切相关，目前已有研究表明，STARD3是与脂代谢相关的重要基因。关于大河乌猪STARD3基因功能作用等的研究报道还鲜少见。因此，本研究对猪脂代谢的相关基因STARD3进行分子鉴定、组织表达及多态性分析，为将来利用该基因改进养猪生产亦或作为模式动物研究人类相关疾病奠定分子基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料与数据分析

2020年5月，在云南农业大学自有动物试验群中随机采集200头成年大河乌猪的肺脏组织、脂肪组织、脾脏组织、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、小肠组织和肌肉组织，采用GENSCAN工具对cDNA序列进行预测，利用美国国立生物技术信息中心生物大分子序列比对搜索工具对序列的同源性进行分析，利用CLUSTAL OMEGA对蛋白质进行预测和分析。对STARD3基因编码的蛋白质的等电点和分子量进行预测采用COMPUTER PI和MW TOOL工具进行。组织表达特异性分析使用Applied Biosystems 7900HT SDS来进行检测。对开放阅读框的分析使用美国国立生物技术信息中心中的开放阅读框查询软件进行。猪STARD3基因的组织表达分析采用qRT-PCR的方法进行。

2.2 试验方法

分离猪STARD3基因的全长cDNA。引物使用引物设计软件Primer Premier 5.0进行并设计5'-RACE和3'-RACE引物（表1）。RACEPCR反应程序：94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min条件下进行5个循环；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min条件下进行5个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃3 min条件下进行30个循环直至本次反应程序终止。对PCR引物扩增产物进行检测及鉴定使用凝胶电泳。

表1 STARD3基因5'-和3'-RACE引物

扩增反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测外，剩余产物用于0.8%琼脂糖凝胶电泳并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对特异性条带切胶回收。最后进行测序。

3 结果与分析

3.1 大河乌猪STARD3基因全长cDNA序列的分子克隆

经过3'-RACE和5'-RACE扩增，得到了两个片段，一条长度为787 bp，一条长度为1 485 bp（图1）。随后将这些RACE-PCR产物分别插于T-载体进行克隆测序，最终得到一条长度为2 092 bp的cDNA。

图1 大河乌猪STARD3基因RACE扩增结果

3.2 大河乌猪STARD3基因的序列分析

将大河乌猪STARD3基因cDNA核苷酸序列通过BLAST比对发现和已知的猪的任何基因都不同源，因此将序列提交到GenBank数据库（Accession number：FJ436388）。运用GENSCAN软件对该长度为2 092 bp的cDNA序列进行基因预测，发现一个编码436个氨基酸的完全单基因。对该蛋白质的等电点（pI）以及分子量（Mw）的计算，采用Compute pI/Mw Tool软件，计算出该基因编码的蛋白质的等电点为7.65，分子重量为49 480.15 Da。

进一步比对分析发现该蛋白质与家犬（Canis lupus familiaris）（accession number：XP_005624610）的STARD3蛋白具有93.9%的同源性、布氏蝙蝠（Myotis brandtii）（accession number：XP_005861953）的STARD3蛋白具有91.8%的同源性、海象（Odobenus rosmarus divergens）（accession number：XP_004395107）的STARD3蛋白具有93.4%的同源性、北海狗（Callorhinus ursinus）（accession number：XP_025714963）的STARD3蛋白具有93.6%的同源性、小棕蝠（Myotis lucifugus）（accession number：XP_023620112）的STARD3蛋白具有91.8%的同源性。

在以上STARD3蛋白质比对的结果基础上，通过EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk）中的Clustal Omega工具（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）构建了STARD3基因进化树（图2）。

图2 猪STARD3基因进化树分析

基因进化分析的结果表明，大河乌猪的STARD3基因与布氏蝙蝠（Myotis brandtii）的STARD3基因的遗传关系较近。

3.3 大河乌猪STARD3基因的基因变异分析

在猪蛋白数据库进一步比对分析发现，大河乌猪STARD3蛋白还存在2个变异体Isoform X1（accession number：XP_005653968.1）和Isoform X2（accession number：020921702.1），均与猪STARD3蛋白具有98%的高度相似性。

通过对猪基因数据库的进一步比对分析发现，大河乌猪的STARD3蛋白质编码区还存在4个突变位点（表2）。

表2 大河乌猪STARD3基因变异分析

3.4 大河乌猪STARD3基因的基因结构分析

用大河乌猪STARD3基因编码区cDNA序列作为种子序列，与猪基因组全序列进行比对，获得了猪STARD3基因的基因编码区完整基因组序列，大河乌猪STARD3基因编码区完整的基因组序列在Duroc猪染色体12的NC_010454.4片段被包含，猪STARD3基因组序列包含了14个外显子和13个内含子，长度为10 559 bp。

3.5 大河乌猪STARD3基因的组织表达谱分析

组织表达谱分析发现STARD3在肌肉、脂肪、肺脏、肾脏、小肠和肝脏中高度表达，在心脏和脾脏中中等表达（图3）。

图3 大河乌猪STARD3基因的组织表达谱分析

4 讨论

本试验首次对大河乌猪STARD3基因的cDNA序列全长进行克隆，为后续以猪为动物模型研究STARD3基因对脂代谢和相关疾病奠定基础。目前相关研究表明，过表达STARD3可以阻止乙酰化低密度脂蛋白（VLDL）引起的胆固醇酯化增加，从而阻止胆固醇酯沉积[11]。巨噬细胞在分化的过程中，STARD1的mRNA和蛋白随着甾醇含量的增加而增加，而STARD3则相反。肝X受体（LXR）激动剂、PPARγ和维甲酸X受体对STARD1的表达有促进作用。乙酰化或氧化低密度脂蛋白诱导的病理生理“泡沫细胞”的形成显著降低了STARD1和STARD3基因的表达。STARD1和STARD3的不同调控反映了它们在巨噬细胞胆固醇代谢中的不同作用，并可能为抗动脉粥样硬化的策略提供信息[13]。在后续的研究中，我们将对猪STARD3基因的作用机制进行研究，寻找与人类STARD3基因具有相同的突变基因型个体作为模式动物，对STARD3基因与脂代谢疾病之间的关系进行进一步的研究。

5 结论

大河乌猪STARD3基因完整全长cDNA序列为2 092 bp，编码436个氨基酸，等电点为7.65，分子量为49 480.15 Da。猪STARD3基因编码的蛋白与家犬、布氏蝙蝠、海象、北海狗、小棕蝠的STARD3蛋白分别具有93.9%、91.8%、93.4%、93.6%、91.8%的高度同源性。猪STARD3基因的基因组序列包含14个外显子和13个内含子，共10 559 bp。大河乌猪STARD3基因编码区存在4个突变位点。猪STARD3基因与布氏蝙蝠的STARD3基因有着较近的亲缘关系。STARD3在肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和小肠中高度表达，在心脏和脾脏中中等表达。