BRAFV600E基因突变与PTC患者病灶数目及碘摄入量的相关性分析

李小妹，李 想，王利利，杜丽艳，宋爱林

甲状腺癌（thyroid cancer，TC）是临床多见的内分泌系统恶性肿瘤，且发病率呈逐年增加趋势，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid of carcinoma，PTC）占80%～90%[1]。越来越多研究发现，PTC与鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murinesarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基 因 突 变 存 在 相 关 性。随 着BRAFV600E基因突变研究的深入，该突变已被证实是影响PTC侵袭性的危险因素，且多中心临床研究结果显示，BRAFV600E基因突变与肿瘤侵袭性病理特征、复发、生存情况密切相关[2，3]，因此研究BRAFV600E基因突变的相关因素对于临床治疗具有重要指导意义。流行病学研究表明，长期高碘摄入可增加PTC发生风险，而PTC中是BRAFV600E基因突变最常见、最有特异性遗传突变[4]，故而可推测BRAFV600E基因突变与高碘摄入量存在相互关系。在临床实践发现仍有部分BRAFV600E突变型PTC患者有良好预后，表明BRAFV600E基因突变难以有效预测PTC患者预后情况[5]。PTC患者手术方式是影响预后重要因素，而病灶数目、病灶分布决定手术方式选择，如单灶或者多灶位于一侧腺叶者，以甲状腺患侧叶及峡部切除联合患侧中央区淋巴结清扫术为主；多灶位于两侧者，则需行甲状腺全切联合双侧中央区淋巴结清扫术[6]。目前，关于BRAFV600E基因突变与PTC患者病灶数目及碘摄入量关系尚不明确，因此笔者将通过实例进一步探讨和研究BRAFV600E基因突变与术后复发的关系，旨在为临床治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 临床材料

选择2018年6月至2020年10月在邢台医学高等专科学校第一附属医院收治的248例PTC患者，其中男性68例，女性180例；年龄32～70岁，平均年龄52.28岁（标准差5.44岁）；肿瘤T分期，T1期148例，T2期61例，T3期30例，T4期9例；病灶数目，单病灶176例，多病灶72例；淋巴结转移57例。

选择标准：①符合术后病理诊断为PTC，且接受碘放射治疗；②患者均接受BRAFV600E基因检测；③均初次接受甲状腺手术，术前未曾接受过放化疗及其他辅助治疗；④临床病理资料完整，且均完成3年随访；⑤患者均签署知情同意书，且该研究已获得伦理委员会批准。

排除标准：①复发后再次手术或者因残余癌灶而行二次手术；②合并其他部位非甲状腺转移性肿瘤；③合并有其他病理类型的TC；④头颈部放射治疗史及远处转移；⑤未行中央区淋巴结清扫。

1.1.2 主要试剂与仪器

BRAFV600E基因突变荧光试剂盒（检测灵敏度为1%。厦门艾德生物医药科技股份有限公司，中国）。7500型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）系统（Applied Biosystems，美国）。

1.2 方法

1.2.1 BRAFV600E突变基因检测

于PTC手术中获取PTC组织标本。

采用实时荧光定量PCR技术的扩增阻滞突变系统检测法进行BRAFV600E突变基因检测，实验过程按试剂盒操作步骤进行。借助Primer 5引物设计软件设计引物。

PCR反应体系共50μL，包括上、下游引物各2μL，0.25μL Taq酶，10μL 2×Taq PCR MasterMix，1μL DNA模版，2μL dNTP Mixture，无菌水定容至50μL。PCR扩增条件：95℃×10 min；92℃×15 s，60℃×60 s，共45个循环。PCR产物经纯化后，取5μL扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯检查扩增结果。根据突变情况分为突变组和未突变组。

1.2.2 观察指标

根据突变情况对患者进行分组后，统计两组癌灶平均大小、淋巴结阳性（指淋巴结清扫个数高于5个，检测到至少5个淋巴结发生转移）、T分期（tumor node metastasis classification）（参照第8版TNM系统[7]，T1为原发灶最大径≤3 cm，T2为原发灶最大径3～5 cm，T3为原发灶最大径5～7 cm，T4为原发灶最大径＞7 cm）、复发风险分级[高风险：肿瘤不完全切除，轻微腺外侵犯，远处转移淋巴结（＞3 cm）；中风险：轻微腺外侵犯，具有侵袭性组织学，血管侵犯或≥5个淋巴结（0.2～3.0 cm）；低风险：局限于腺内的分化型甲状腺癌，＜5个淋巴结微转移（＜0.2 cm）[2]]、腺外侵犯（病理学检查报告显示肿瘤侵犯甲状腺外纤维脂肪组织）、病灶数目、碘摄入量。

1.2.3 肿瘤无复发生存分析

对PTC患者进行随访。分析病灶数目、碘摄入量、BRAFV600E基因突变与肿瘤无复发生存（relapse free survival，RFS）关系。根据病灶数目分组，分为单灶性组和多灶性组；根据突变情况分为突变组和未突变组；以尿碘值表示碘摄入量，采用过硫酸铵消化砷铈催化分光光度法检测尿碘值，以尿碘值中位数值为临界值，将患者分为高碘摄入组和低碘摄入组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。连续型正态分布计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料以例数（%）表示，采用χ2检验。肿瘤RFS分析采用Kaplan-Meier检验，采用Cox多元回归分析BRAFV600E基因突变相关危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基线资料比较

248例PTC患者中BRAFV600E基因突变178例（71.77%），未突变70例（28.23 %）。两组患者的性别、年龄、癌灶平均大小、淋巴结阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。复发风险分级、腺外侵犯、T分期、病灶数目及碘摄入量与BRAFV600E基因突变有关（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者基线资料比较Tab.1 Comparison of baseline data between 2 groups

2.2 BRAFV600E基因突变相关因素Cox多元回归分析

Cox多元回归分析显示，复发风险分级、腺外侵犯、T分期、病灶数目及碘摄入量均是BRAFV600E基因突变相关危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 BRAFV600E基因突变相关因素Cox多元回归分析Tab.2 Cox multiple regression analysis of BRAFV600E gene mutation related factors

2.3 肿瘤无复发生存分析

2.3.1 基于BRAFV600E基因突变分层PTC患者的RFS分析

随访3年，共有54例患者复发。突变组与未突变组PTC患者的RFS曲线差异有统计学意义（χ2=4.295，P=0.038），突变组患者有更高的复发风险，风险比（hazard ratio，HR）（95 % CI）=2.095（1.034～3.330）。见图1。

图1 突变组与未突变组PTC患者的RFS曲线比较Fig.1 Comparison of RFS curves between mutation group and non-mutation group of PTC patients

2.3.2 基于病灶数目分层PTC患者的RFS分析

病灶数目多灶性组与单灶性组PTC患者的RFS曲线差异有统计学意义（χ2=4.349，P=0.037），多灶性组患者有更高的复发风险，HR（95%CI）=1.775（1.040～3.488）。见图2。

图2 多灶性组与单灶性组PTC患者的RFS曲线比较Fig.2 Comparison of RFS curves between multiple lesions group and single lesion group of PTC patients

2.3.3 基于碘摄入量分层PTC患者的RFS分析

高碘摄入量组（118例）与低碘摄入量组（130例）PTC患者的RFS曲线差异有统计学意义（χ2=4.602，P=0.032），高碘摄入量组患者有更高的复发风险，HR（95%CI）=1.804（1.052~3.065）。见图3。

图3 高碘摄入量组与低碘摄入量组PTC患者的RFS曲线Fig.3 Comparison of RFS curves between high-iodine-intake group and low-iodine-intake group of PTC patients

3 讨论

PTC属于分化良好的恶性肿瘤，死亡风险较低，10年生存率高达90%，即使患者确诊时已发生颈部淋巴结转移，仍具有较好预后情况[8]。PTC中约40%～80%患者存在BRAFV600E基因突变，BRAFV600E基因突变是PTC中最常见的遗传学改变。BRAFV600E基因突变是PTC侵袭性分子机制的致癌基因，参与调控肿瘤侵袭性病理特征，影响肿瘤复发及预后，因此临床上可根据BRAFV600E基因突变情况筛选高危人群，从而指导临床精准治疗及预后评估。

笔者研究结果显示基因突变发生率为71.77 %（178/248例），与既往研究结果相近[9，10]。BRAF基因位于人类7号染色体，其作用是编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，进而调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路，影响细胞的生长、增殖、分化、分裂等生物学过程。BRAF基因突变中T1799A点突变占90%以上，即第600位密码子的谷氨酸替代缬氨酸（V600E），进而导致编码的激酶活化，促进细胞的无限增殖、分裂，最终发生癌变，故而BRAFV600E基因突变对于PTC的发生、发展具有重要意义[11]。笔者研究结果显示，复发风险分级、腺外侵犯、T分期、病灶数目及碘摄入量与BRAFV600E基因突变有关（P＜0.05），且通过Cox多元回归分析进一步证实以上临床病理特征均是BRAFV600E基因突变相关危险因素 （P＜0.05）。Ayala MD等[12]研究表明，存在BRAFV600E基因突变的PTC患者，即使确诊时处于疾病早期阶段，肿瘤的复发风险也高于野生型（未发生基因突变），推测认为基因突变可降低对放射性131I的吸收率，进而影响PTC的预后，从而增加复发风险。另外，从分子水平上推测认为，长期的高碘摄入导致钠碘同向转运体mRNA表达降低，抑制甲状腺组织摄取碘及甲状腺激素合成，进而引起下丘脑过度分泌促甲状腺激素，使得发生甲状腺肿，引起甲状腺癌的发生，而PTC患者中多数存在BRAFV600E基因突变[13，14]，故而笔者研究显示高碘摄入量是BRAFV600E基因突变相关危险因素。BRAFV600E基因突变在PTC癌组织中具有高度的特异性，是PTC侵袭性分子机制的致癌基因，进而增加腺外侵袭、淋巴结转移风险，增加肿瘤病灶数目，故而肿瘤病灶数目与BRAFV600E基因突变显著相关。

尽管PTC患者死亡风险较小，但疾病复发率仍然较高，特别是BRAFV600E基因突变的PTC患者，需要接受更彻底的治疗方案，且配合长期随访，从而降低疾病复发、死亡风险。国外很多研究表明BRAFV600E基因突变者预后较差[15]，在中国PTC患者中BRAFV600E基因突变率较高，但并没有明确证据显示BRAFV600E变异型预后更差，因此该基因突变在评估PTC患者预后中的价值尚待确证。笔者研究结果显示，随访3年，共有54例患者复发，其中BRAFV600E基因突变组患者有更高的复发风险（P＜0.05），与朱长雨等[5]研究结果相近，BRAFV600E基因突变加强PTC的侵袭性，是PTC复发的高危因素。研究认为BRAFV600E与老年PTC患者间存在更明显的相关性，相对年轻患者具有更差的临床结果，包括更高的PTC复发率和特异性死亡率[16]，结合此次研究结果，进一步证实BRAFV600E基因突变可增加术后复发风险。Angell TE等[17]研究认为BRAFV600E基因与PTC患者的异常免疫反应有关，即突变型基因可能增加肿瘤免疫抑制，导致PTC预后不良。同时，笔者研究显示，高碘摄入量组患者有更高的复发风险（P＜0.05），分析认为长期的高碘摄入一方面可通过“脱逸”现象、Wolff Chaikoff效应引起胶质性甲状腺肿，并诱发自身免疫反应、细胞凋亡，进而导致甲状腺细胞过度死亡；另一方面，还可以抑制钠碘同向转运体表达、转录，损伤甲状腺滤泡上皮细胞的摄取碘功能，进而减少甲状腺激素分泌，升高促甲状腺激素水平，促甲状腺激素的长期刺激引起甲状腺滤泡上皮细胞增生，最终增加TC发生风险[18]。BRAFV600E基因突变、高碘摄入均可降低钠碘同向转运体mRNA表达，进而降低甲状腺癌细胞摄碘能力，最终影响放射性碘的治疗效果，增加术后复发风险。另外，多灶性组患者有更高的复发风险（P＜0.05），分析认为病灶数目影响手术切除范围的选择，多病灶手术切除相对复杂，特别是对于难以识别的微小肿瘤，往往容易忽视而导致肿瘤残留，增加复发风险，因此对可疑病灶进行基因检测[19]，可为穿刺组织的病理诊断提供重要线索。

综上所述，PTC患者病灶数目及碘摄入量均是BRAFV600E基因突变相关危险因素，多灶性、高碘摄入量、BRAFV600E基因突变患者有更高的复发风险。