桔梗PgHMGS和PgHMGR基因克隆与原核表达分析

余函纹， 刘梦丽， 李 景， 彭华胜， 韩邦兴， 查良平, 2*， 桂双英, 3, 4, 5*

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，安徽 合肥 230012；4.现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心，安徽 合肥 230012；5.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；6.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237010)

桔梗始载于《神农本草经》[1]。桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.的干燥根，有宣肺利咽、祛痰排脓的功效[2]。桔梗作为我国传统的药食同源类品种，也是著名的十大皖药之一，主产于安徽、山东、内蒙古等地区[3]。桔梗中含有多种生物活性成分，包括三萜皂苷、黄酮、酚、多糖等，其中三萜皂苷为桔梗的主要活性成分。桔梗皂苷具有抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[8-9]、护肝[10-11]等作用。

目前已从桔梗中分离并鉴定的三萜皂苷类成分有70余种，均为齐墩果烷型三萜皂苷，依据桔梗皂苷母核结构变化规律可将桔梗皂苷分为桔梗酸类、桔梗二酸类和远志酸类3种主要类型[12]。桔梗皂苷生物合成主要包含3个阶段。起始阶段通过MVA途径和MEP途径生成萜类前体物质二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)[13]。MVA途径是植物中三萜生物合成的主要前体途径[14-15]，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)和HMG-CoA合成酶(HMGS)作用下生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)[16]。HMG-CoA又在HMG-CoA还原酶(HMGR)催化下生成MVA，MVA又在多种酶的相继催化作用下生成IPP[17]。HMGS和HMGR是MVA途径的关键酶，其基因的表达影响着酶的活性，从而影响着萜类物质的生成。骨架形成阶段是指DMAPP和IPP在一系列酶的催化下生成为2，3-氧化鲨烯，再经过氧化鲨烯环化酶(OSC)环化生成萜类骨架。修饰阶段是指CYP450和糖基转移酶(UGT)对萜类骨架进行氧化、置换、糖基化等一系列修饰以生成各种皂苷。

目前，HMGS和HMGR已在多种药用植物中被克隆，如拟南芥[18-19]，丹参[20-21]，三七[22]等，但在桔梗物种中还未被克隆。张健等[23]对HMGS、HMGR基因在不同生长年限的桔梗根中的差异表达情况进行分析，发现HMGS和HMGR均在一年生桔梗根中表达最高。马春花等[24]通过转录组测序、功能注释及基因组织特异性表达分析，共鉴定出19个与桔梗三萜皂苷合成相关的关键基因，其中HMGS和HMGR基因分别在叶和根中表达最高。

本研究基于转录组数据首次克隆得到桔梗MVA途径的关键酶基因PgHMGS和PgHMGR的全长序列，并进行相关生物信息学分析，构建重组表达载体，转化到大肠杆菌进行异源表达，为揭示桔梗三萜皂苷类物质生物合成的分子机理提供理论依据。

1 材料

两年生桔梗样品于2019年采自安徽省桐城市，经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.。收集的样品经液氮速冻后储存于实验室-80 ℃冰箱。

Trans1-T1、E.coliTransetta(DE3)、T载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、无缝拼接、切胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；pET-28a(+)、pET-32a(+)质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自美国Sigma公司; 实验所需的各种酶购自英国Biolabs公司；实验所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 转录组分析组装与RNA提取 通过华大测序平台对桔梗样品进行测序，测序所得的原始数据经过过滤软件SOAPnuke的过滤[25]，去除接头、去除未知碱基N含量大于10%及低质量的读取，生成高质量的干净读取。使用Bowtie2将干净读取比对到参考基因序列，之后再使用RSEM计算基因和转录本的表达水平[26-27]。

取约80 mg新鲜桔梗根，加液氮置球磨机上研磨成粉，采用CTAB法提取总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，超微量紫外分光光度计ND2000测定桔梗总RNA的A260、A280值，总RNA经反转录试剂盒反转录成cDNA。

2.2PgHMGS,PgHMGR基因克隆 通过从NCBI中调取其他物种HMGS、HMGR基因序列，作为为模板从桔梗转录组数据中调取桔梗HMGS、HMGR，通过去除不完整、重复序列，筛选得到一条PgHMGS和一条PgHMGR。通过Primer软件设计基因特异性引物。上游引物PgHMGS-F 5′-ATGGCTTCTAACCCGAAGAATGTTG-3′，PgHMGR-F 5′-ATG GACGTCCGATCAACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-R 5′-TCAATGGCCATTGGCCACCGGTGCA- 3′，PgHMGR-R 5′-CTAAGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以反转录后的桔梗cDNA为模板，采用高保真酶Phusion进行PCR扩增，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。目的条带使用切胶回收试剂盒回收。将切胶回收产物连接至T载pEASY-Blunt Zero，转化至大肠杆菌Trans1-T1，接种氨苄青霉素抗性固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证，将阳性克隆菌液送至苏州金唯智公司测序。

2.3PgHMGS,PgHMGR基因的生物信息学分析 菌液测序的序列结果与原序列比对成功后，使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定基因序列的ORF区并通过在线工具BLAST对其核苷酸序列和氨基酸序列进行同源比对分析以确认克隆结果正确性；利用ExPASy(https://web.expasy. org/protparam/)预测基因编码蛋白大小、氨基酸数目、等电点等理化性质；WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)预测蛋白的亚细胞定位；NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测蛋白的二级结构；Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)结合PyMOL软件构建蛋白三级结构模型；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cd d/wrpsb.cgi)分析蛋白序列的结构域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/service s/TMHMM/)分析蛋白序列的跨膜结构域；从NCBI中获取其他植物HMGS和HMGR基因的氨基酸序列，运用MEGA7.0软件的ClustalW将PgHMGS和PgHMGR与其他植物氨基酸序列进行同源比对后构建Neighbor-joining系统进化树(bootstrap重复次1 000次)。

2.4PgHMGS,PgHMGR基因的原核表达 对测序后的序列进行分析，设计含有BamH Ⅰ酶切位点的无缝拼接引物，上游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-F：5′-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTTCTAACCCGAAGAA TGTTG-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-F 5′-AGGCCATGGCTG ATATCGGAATGGACGTCCGATC AACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-R：5′-CGACGGAGCTCGAAT TCGGA TCAATGG CCATTGGCCACCGGTGCA-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-R 5′-CGACGGAGCTCG AATTCGGACTA AGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以重组质粒为模板，进行PCR扩增。用BamH Ⅰ限制性内切酶对pET-28a(+)和pET-32a(+)进行单酶切。目的基因片段与原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)使用无缝拼接试剂盒pEASY于50 ℃连接30 min，转化至大肠杆菌Trans1-T1，接种到LB固体培养基上(卡那霉素或氨苄霉素抗性)，挑取单菌落进行菌液PCR阳性验证、测序及质粒提取。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建转化表达宿主菌。按1∶100的比例取转化菌液加入LB液体培养基中(卡那霉素或氨苄霉素抗性)，37 ℃，振荡培养，至OD600=0.4～0.6，在0.8 mmol/L IPTG条件下，20 ℃ 诱导12 h，pET-28a(+)，pET-32a(+)空载作为阴性对照。取1 mL菌液作为全菌离心(10 000×g，3 min，4 ℃)，1 mL PBS清洗后离心收集菌体(10 000×g，3 min)，余下菌液离心(5 000×g，3 min，4 ℃)后用5 mL His Buffer A(20 mmol/L Na3PO4·12H2O、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑)重悬，置冰浴中超声破碎、离心(10 000×g，15 min，4 ℃)后获得上清，上述样品加入上样缓冲液，沸水煮8 min，经12% SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。

3 结果

3.1 基因克隆及序列分析 基于桔梗转录组数据获得PgHMGS和PgHMGR基因的cDNA序列，利用DNAMAN软件结合ORF Finder对PgHMGS和PgHMGR基因cDNA序列进行分析，其ORF区分别为1 401、1 749 bp，分别编码466、582个氨基酸。以桔梗cDNA为模板，PCR进行目的基因扩增，产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小与目的基因大小一致(图1)。将PgHMGS和PgHMGR基因提交到NCBI使用在线软件BLAST进行序列比对。PgHMGS和PgHMGR与GenBank中已注册植物基因有较高的同源性，其中PgHMGS与三七HMGS(注册号AGZ15317.1)的相似性为99.57%，PgHMGR与丹参HMGR(注册号AEZ55672.1)的相似性为79.30%。

3.2 生物信息学分析 利用在线工具ExPASy对PgHMGS，PgHMGR基因编码蛋白进行理化性质分析，预测PgHMGS的相对分子质量为51 384.26，编码蛋白的理论等电点为5.83，不稳定系数为38.83，脂肪指数为74.33，负电荷残基总数为54，正电荷残基总数为46；预测PgHMGR相对分子质量为62 477.81，编码蛋白的理论等电点为6.51，稳定系数为39.25，脂肪指数为95.02，负电荷残基总数为54，正电荷残基总数为51；初步推测PgHMGS，PgHMGR为稳定的酸性蛋白。利用在线软件WoLF PSORT预测PgHMGS，PgHMGR分别定位于线粒体膜和内质网。

根据PgHMGS，PgHMGR基因的氨基酸序列，利用NPS在线软件预测多肽链中氨基酸序列的二级结构(图2)。NPS预测结果表明，PgHMGS，PgHMGR蛋白的二级结构都由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲组成，其中无规则卷曲结构占比最大。PgHMGS的无规卷曲结构包含214个氨基酸，占比为45.92%，α-螺旋包含186个氨基酸，占比为39.91%，延伸链包含66个氨基酸，占比为14.16%；PgHMGR的无规卷曲结构包含258个氨基酸，占44.38%，α-螺旋包含231个氨基酸，占39.69%，延伸链包含93个氨基酸，占15.98%。两种基因二级结构的规律均为无规卷曲>α-螺旋>延伸链。使用在线软件SWISS-MODEL对PgHMGS，PgHMGR进行同源建模，构建其3D结构模型(图2)。选择芥菜Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss. HMGS为模板(SMTL ID：2fa3.1)构建PgHMGS模型[28]，序列相似性为82.14%，整体评分为0.89；选择肝HMGR为模板(SMTL ID：2r4f.1)构建PgHMGR模型[29]，序列相似性为57.14%，整体评分为0.79。

利用NCBI的 Conserved domains在线工具对PgHMGS，PgHMGR蛋白结构功能域进行分析。结果表明，PgHMGS的4～466 aa具有PLN02577家族(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)的保守结构域，PgHMGR的171～574 aa具有HMG-CoA_reductase_classI家族(HMG-CoA还原酶)的保守结构域(图3)。利用TMHMM在线工具预测PgHMGS，PgHMGR蛋白的跨膜结构域，结果表明，PgHMGS无跨膜结构，属于膜外蛋白。PgHMGR有两个跨膜结构域，分别位于54～76、96～118、77～95 aa位于膜内，1～53、119～582 aa位于膜外(图3)。

利用DNAMAN软件对PgHMGS和PgHMGR的氨基酸序列与其他植物基因进行氨基酸序列同源比对。将PgHMGS序列与三七PnHMGS(AIK21781.1)、洋常春藤HhHMGS(APY22353.1)进行多序列比对分析，三种HMGS基因的一致性为92.57%，都有保守的催化结构域GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL。将PgHMGR序列与茶CsHMGR(AEO12148.1)、丹参SmHMGR(AEZ55672.1)进行多序列比对分析，三种植物HMGR基因的一致性为77.83%(图4)，均具有HMG-CoA底物结合区域(TTEGCLVA)和NADPH结合保守区域(DAMGMNM、GTVGGGT)。

从NCBI中下载了其他植物的HMGS、HMGR的氨基酸序列，采用MEGA7.0软件采用邻接法构建系统进化树(图5)。结果显示，来源于不同物种基因的蛋白被聚成双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和菌类。其中，PgHMGS与五加科植物三七、洋常春藤HMGS聚为一支，表明同源性较高。PgHMGR与唇形科植物丹参、山茶科植物茶聚为一支，具有较高同源性。

3.3 原核表达载体构建及诱导表达 将重组质粒pET-28a(+)-PgHMGS、pET-32a(+)-PgHMGR转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，菌液PCR验证，阳性菌株测序验证，证实目的基因已成功插入表达载体。同时，pET-28a(+)和pET-32a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照。在0.8 mmol/L IPTG，20 ℃诱导12 h条件下，观察重组融合蛋白的表达。重组菌株表达后收集菌体并进行破碎裂解，上清液进行12% SDS-PAGE凝胶电泳检测。电泳结果显示，pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR的菌株和上清液分别在45、70 kDA处出现条带，与预测结果一致(图6)。

4 讨论

目前，植物转录组学研究对植物活性成分合成途径关键酶基因的挖掘已经成为研究热点[30]，期望通过分子手段来实现植物药用成分的大量积累。桔梗的药用价值来源于桔梗三萜皂苷类成分。乙酰辅酶A在HMGS、HMGR的相继催化下生成MVA，MVA的生成是一个不可逆过程，因此HMGR被认为是MVA途径中的第一个限速酶[31]，对MVA途径调控起重要作用。HMGS、HMGR基因的功能已经得到证实。王家典等[32]通过实验证实雷公藤HMGR基因的过表达显著增加了雷公藤悬浮细胞藤甲素和雷公藤红素的含量。Kim等[33]采用HMGR竞争性抑制剂美维诺林处理四周生的人参不定根24 h后，人参不定根中人参总皂苷含量降低。芥菜HMGS基因在拟南芥中过表达上调了HMGR的表达，提高拟南芥的甾醇含量和胁迫耐受性，证明HMGS与HMGR可以相互协同共同来调节MVA代谢通路[34]。

本研究克隆得到PgHMGS和PgHMGR，其基因长度分别为1 401、1 749 bp，推测分别编码466、582 aa，均为酸性稳定蛋白。生物信息学分析表明PgHMGS不具有跨膜结构，为膜外蛋白，与厚朴[35]、桑黄[36]HMGS蛋白跨膜结构预测结果一致。亚细胞定位预测PgHMGS在线粒体膜上起作用。PgHMGS与三七、洋常春藤HMGS氨基酸序列同源性比对结果显示序列具有92.57%的高度相似性，且都具有由21个氨基酸组成的保守催化结构域(GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL)[37]，表明不同物种间的HMGS具有高度的保守性。通过分析发现PgHMGR具有两个跨膜结构域，与茅苍术[38]、罗汉果[39]HMGR蛋白跨膜结构预测结果一致。预测PgHMGR定位于内质网，推测该蛋白可能为某种物质的膜受体或者参与内质网的物质运输[40]。PgHMGR与丹参、茶HMGR同源性比对显示序列相似性为77.83%。通过序列分析发现，桔梗、丹参、茶3种植物的HMGR均包含1个底物HMG-CoA结合区域(TTEGCLVA)和2个NADPH结合区域(DAMGMNM和GTVGGGT)。PgHMGR发挥酶催化作用时，连同NADPH作为反应供氢体一起催化HMG-CoA生成MVA，首先一分子的NADPH还原形成半缩硫醛中间体，然后分解、质子化，最后NADPH替代NADP+将聚乙醛还原为MVA[41]。

解析药用植物活性成分合成途径，通过分子手段实现大批量药用成分的生产，可以提高药用植物利用率。本研究成功克隆桔梗MVA途径的HMGS和HMGR基因并进行生信分析，同时构建了重组质粒pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR，将其导入大肠杆菌中进行原核表达，成功诱导出可溶性蛋白，为进一步研究桔梗HMGS、HMGR基因的体外功能奠定基础，也为进一步研究桔梗中三萜类成分的生物合成提供物质基础。