鹿茸大补汤对支气管哮喘豚鼠的作用机制

金丽娜， 姜京植， 宋艺兰， 李良昌， 延光海， 孟庆玲， 李 欢， 郑明昱

(延边大学医学院，吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向研究重点实验室，吉林 延吉 133002)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性的气道炎症性疾病，多种细胞可与上皮细胞相互作用，引起气道高反应性、气道炎症和气道重塑[1]，其发病机制与辅助性T细胞1(Th1)/辅助性T细胞2(Th2)失衡有关。普遍认为Th2型相关细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，在哮喘中占主导地位[2]。自噬是细胞的降解和再循环过程，是发生在真核细胞上由溶酶体介导并且高度保守的过程[3]。Th1/Th2细胞因子反应在自噬过程中起着调节作用[4]。Th1细胞因子刺激自噬，而Th2细胞因子抑制自噬[5]。UNC-51样激酶1(ULK1)是启动自噬的关键蛋白，可调节前自噬体的形成[6]，自噬相关蛋白6(Beclin-1)是自噬体形成过程中必需分子[7]，微管相关蛋白光链3(LC3)是自噬的标志物[8]，与自噬有密切的联系。研究显示，Th2型相关细胞因子对Beclin-1，LC3具有调节作用[9-11]。

鹿茸大补汤出自《东医寿世保元》，具有补肺泻肝、化痰平喘、标本兼顾功效，对哮喘缓解期患者有较好的疗效[12-13]。课题组前期研究发现，鹿茸大补汤可以有效抑制哮喘气道炎性细胞因子，改善肺组织损伤[14]。基于此，本实验将从自噬角度探讨鹿茸大补汤缓解哮喘的作用机制，为鹿茸大补汤防治哮喘提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 健康雄性豚鼠50只，体质量(200±30)g，由延边大学医学部实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(吉)2017-0003。实验前适应性喂养1周。

1.2 试剂与药物 鹿茸大补汤由鹿茸10 g、麦冬7.5 g、薏苡仁7.5 g、麻黄5 g、山药5 g、杏仁5 g、天冬5 g、五味子5 g组成，购于延吉市北京同仁堂药店，经专家鉴定为正品，各药材在蒸馏水中浸泡1 h后分别加10、8倍量水提取2次，每次1 h，旋转蒸发仪浓缩至1∶1，备用。卵清蛋白(OVA)(货号9006-59-1)、HE染色试剂盒(货号G1120)、PAS染色试剂盒(货号G1280)、Masson染色试剂盒(货号G1345)购自北京索莱宝科技有限公司；氢氧化铝凝胶(货号77161)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；免疫组化试剂盒(货号pv-9000)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；IL-4 ELISA试剂盒(货号bsk12003)、IL-5 ELISA试剂盒(货号bsk12019)、IL-13 ELISA试剂盒(货号bsk12006)、LC3抗体(货号bs-8878R)、ULK1抗体(货号bs-3602R)、Beclin抗体(bsm-33323R)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 NE-C29型欧姆龙压缩式雾化吸入器(大连药材集团有限公司医疗器械厂)；041BR87950型垂直电泳仪及电泳槽、76120280型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；5404P806820型高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；180222B EP-OCH型酶标仪、9.557.127 Cytation5型细胞成像微孔板检测系统(美国Beckman公司)。

2 方法

2.1 分组与造模 将豚鼠随机分为正常组，模型组，鹿茸大补汤低、高剂量组，地塞米松组。除正常组外，其余各组豚鼠腹腔注射1 mL 10%卵清蛋白致敏液(OVA和氢氧化铝)致敏，每周1次，共2次。第21天时，模型组，鹿茸大补汤低、高剂量组及地塞米松组豚鼠再腹腔注射1%卵清蛋白溶液，超声雾化激发，每次至少30 min，每周3次，连续8周。第21天起，正常组、模型组豚鼠于激发前1 h灌胃给予生理盐水，鹿茸大补汤高、低剂量组豚鼠灌胃给予20、5 g/kg鹿茸大补汤(分别为临床等效剂量的1、4倍)，地塞米松组豚鼠灌胃给予5 g/kg地塞米松，每天1次，连续8周。在灌胃过程中豚鼠无死亡，每组最终纳入数量均为10只[15-16]。

2.2 取材 末次给药24 h后处死豚鼠，即刻打开胸腔，暴露气管，回收BALF，3 000 r/min离心5 min，并取上清液，在-80 ℃下冷冻保存，剩余沉淀物用于细胞涂片，Diff-Quick染色，在光学显微镜下进行炎症细胞分类及计数。取豚鼠左肺上叶，在-80 ℃下保存；取左肺中叶，在4%多聚甲醛溶液中进行固定。

2.3 豚鼠BALF中炎性细胞因子水平检测 取豚鼠BALF，解冻后制备洗涤液，稀释标准品，孔内加入样品和抗体进行孵育，再依次加入工作液、显色底物进行孵育，最后加入终止液，用酶标仪检测吸光度值，并计算BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.4 豚鼠肺组织病理学观察 取豚鼠左肺中叶，石蜡包埋切片，常规固定、脱水，进行HE、PAS、Masson染色，观察其组织病理学变化。

2.5 免疫组织化学染色检测ULK1蛋白表达 将肺组织石蜡切片置于60 ℃烤箱中熔蜡以增加切片附着度，脱蜡，脱水，微波加热抗原修复，缓冲液冷却并清洗，一抗、生物酶标记的二抗孵育，DAB显色，苏木复染，脱水，中性树胶封片，观察肺组织ULK1蛋白阳性表达。

2.6 Western blot检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1蛋白表达 提取豚鼠肺组织蛋白，采用BCA法检测浓度，煮沸5 min后经8%、10%、12%、15% SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉-TBST溶液常温封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜，洗膜后加入相应二抗，常温摇床孵育2 h，将膜取出后用ECL试剂曝光，分析蛋白相对表达。

2.7 免疫荧光法检测ULK1、LC3蛋白表达 将标本置于60 ℃烤箱中熔蜡以增加切片的附着度，脱蜡，脱水，微波加热抗原修复，一抗孵育过夜，清洗后用荧光二抗孵育，最后加入DAPI封片，在微孔成像仪下观察拍照。

3 结果

3.1 鹿茸大补汤对豚鼠BALF中炎症细胞数的影响 与正常组比较，模型组豚鼠BALF中炎症细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数增加(P<0.05)；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠BALF中炎症细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数减少(P<0.05)，见图1。

3.2 鹿茸大补汤对豚鼠BALF中炎性细胞因子水平的影响 与正常组比较，模型组豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P<0.05)；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，见图2。

3.3 鹿茸大补汤对豚鼠肺组织病理变化的影响 HE染色显示，正常组豚鼠气道无明显改变；模型组豚鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下层增宽，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞；鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠虽可见炎症细胞浸润等病理表现，但较模型组有所减轻。PAS染色显示，与正常组比较，模型组豚鼠出现明显的杯状细胞增生与黏液分泌；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠上述情况有所减轻。Masson染色显示，正常组豚鼠气道周围胶原纤维沉积较少；模型组豚鼠气道周围胶原纤维沉积增多；鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠气道周围胶原纤维沉积减少，见图3。

3.4 鹿茸大补汤对豚鼠肺组织ULK1蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组豚鼠气道周围ULK1聚集明显；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠ULK1聚集程度有所减弱，见图4。

3.5 鹿茸大补汤对豚鼠肺组织LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表达的影响 与正常组比较，模型组豚鼠肺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表达升高(P<0.05)；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠肺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表达降低(P<0.05)，见图5。

3.6 鹿茸大补汤对豚鼠肺组织ULK1、LC3蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组豚鼠肺组织ULK1、LC3蛋白表达升高；与模型组比较，鹿茸大补汤各剂量组和地塞米松组豚鼠肺组织ULK1、LC3蛋白表达降低，见图6。

4 讨论

哮喘是一种常见的全球性呼吸系统疾病，发病率和死亡率都很高。本研究利用OVA诱导哮喘豚鼠模型来探索鹿茸大补汤对哮喘气道炎症的影响。以地塞米松为阳性对照药物，观察了鹿茸大补汤对哮喘豚鼠肺部炎症的影响。HE染色可以观察到鹿茸大补汤能减轻OVA诱导后气道周围炎性细胞浸润；PAS染色显示鹿茸大补汤能减轻杯状细胞增生与黏液分泌；Masson染色证明鹿茸大补汤可以减轻气道周围胶原纤维增生。以上研究结果显示，鹿茸大补汤能改善OVA诱导的哮喘豚鼠的肺部炎症。

Th1/Th2细胞亚群的失衡是哮喘的发病机制之一，已知Th2型相关细胞因子可促进哮喘患者肺部嗜酸性粒细胞的积累[17]。研究显示，IL-13促进气道杯状细胞分泌过量黏液，激活上皮细胞自噬，相反，抑制自噬能降低IL-13诱导的气道黏液分泌，降低IL-5表达，减少BALF中嗜酸性粒细胞数量[10,18]。本研究结果显示，OVA诱导哮喘豚鼠中炎性细胞因子水平升高，而鹿茸大补汤可以减少炎性细胞因子的表达，证实其对哮喘有抗炎作用。

支气管哮喘属朝鲜族医学的“哮喘”范畴。李济马根据脏腑的虚实，将人分为4种体质。其中太阴人以“肝大肺小”为脏腑功能特点，因其“肺小”在四象人中最易患肺部疾病，因此太阴人哮喘应以补肺泻肝为治法。鹿茸大补汤为太阴人方剂，方中以鹿茸为主药补肺、益精血；麦门冬、薏苡仁、五味子、山药为辅药补肺健胃，助鹿茸益精血；天门冬润肺滋肾；杏仁止咳平喘；麻黄解肺之表邪[14]。诸药合用共凑补肺泻肝，化痰平喘，标本兼顾之功效，符合朝鲜族医学“药乃局限于人”的药性观。

自噬是一个高度保守的基本进化过程，在细胞生长发育、适应性免疫系统及程序化细胞死亡中起着至关重要的作用[19]。研究显示，自噬可能是哮喘发展的一个重要因素，减少肺组织自噬可以改善哮喘[20]。自噬涉及哮喘发病机制的几个关键特征，包括嗜酸性气道炎症、气道高反应性和气道重塑[21-22]。ULK1和ATG13是自噬启动的关键调节蛋白[23]。研究表明，小鼠因缺乏ULK1基因导致自噬功能受到抑制[24]。Beclin-1作为哺乳动物中Atg6的同源蛋白，是ULK1下游的直接靶点，Beclin-1可以从干预自噬体的形成至成熟[25]。LC3-Ⅰ是通过从新合成的LC3中去除C末端的22个氨基酸而形成的，然后将一部分LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，因此常用LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值来评估细胞的自噬表达[8]。本研究发现，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、ULK1在OVA诱导的哮喘豚鼠中呈高表达，表明自噬与哮喘气道炎症的发病机制之间存在联系；而经鹿茸大补汤治疗后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表达被抑制，表明鹿茸大补汤可能是通过抑制自噬从而抑制哮喘气道炎症。

综上所述，鹿茸大补汤可能通过抑制ULK1信号通路对自噬起调节作用，减轻哮喘豚鼠气道周围炎性细胞浸润，从而改善哮喘豚鼠气道炎症反应，缓解哮喘。本次研究仍存在一定的局限性，为了进一步了解鹿茸大补汤在该通路的作用机制，还需要多途径、多靶点深入研究。