蒜氨酸提取工艺评价

敬 爽， 邓丽娟， 李瑞瑞， 宋百灵， 张婷婷， 李新霞*， 李建光*

(1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆埃乐欣药业有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011)

大蒜为百合科葱属植物蒜AlliumsativumL.的地下鳞茎，是一种药食两用植物[1]，具有防止心血管疾病[2]、抗病原微生物[3]、抗氧化[4]等药理活性。蒜氨酸(S-烯丙基L-半胱氨酸亚砜)是大蒜中特有的含硫氨基酸，被《美国药典》选为质量控制的指标成分[5]。

H2S是继NO和CO之后发现的第3种内源性气体信号分子，具有重要的生理功能，大蒜为其天然供体，蒜氨酸、S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)等含硫氨基酸均可在体内生成它[6]。另外，大蒜中还含有大量其他氨基酸，其中精氨酸、谷氨酰胺含量较高，并且后者为还原型谷胱甘肽(GSH)合成提供前体，而GSH可与含硫氨基酸在体内转化为H2S[7]；前者是NO合酶底物，而NO可与H2S产生协同作用保护心肌[8]。同时，大蒜中也含有大量糖类，多糖可促使免疫性肝损伤患者建立新的免疫平衡，从而保护肝脏[9]。

蒜氨酸提取工艺放大过程中采用多种途径进行优化，提取物中含有多种氨基酸和多糖，故需要将有效成分与药效相结合来全面评价并优化工艺。本实验根据合作企业优化工艺提供的多个提取物，提高特征图谱结合多指标药效贡献率来评价蒜氨酸提取工艺。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(型号LC-2010AD-SPD-RID)、紫外分光光度计(型号UV-2700)(日本岛津公司)；电子分析天平(型号AB135-S，瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试剂与药物 三乙胺(天津光复精细化工有限公司，20110509)；异硫氰酸苯酯(北京百灵威试剂有限公司)；正己烷(天津市富宇精细化工有限公司，20150207)；三水醋酸钠[福晨(天津)化学试剂有限公司，20140804]。天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蒜氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)、S-甲基-L-半胱氨酸(SMC)、反-4-羟基-L-脯氨酸、L-天冬酰胺(北京百灵威试剂有限公司)。蒜氨酸对照品(新疆埃乐欣药业有限公司，批号20160615)。硫酸、蒽酮(分析纯)。

1.3 样品 具体信息见表1。

表1 不同提取工艺下蒜氨酸提取物信息

2 方法与结果

2.1 氨基酸特征图谱建立

2.1.1 对照品溶液制备 取各氨基酸对照品适量，制成贮备液，精密量取0.4 mL，加异硫氰酸苯酯、含三乙胺的乙腈溶液各0.2 mL，混匀，40 ℃水浴反应40 min，0.8 mL正己烷萃取2次，合并下层溶液，滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取蒜氨酸提取物100 mg，置于10 mL量瓶中，加水至刻度，精密量取0.4 mL，按“2.1.1”项下方法处理，即得。

2.1.3 色谱条件 参考文献[10]报道，流动相12.6 μg/mL三水醋酸钠(A)-[甲醇-乙腈-水(2∶6∶2)](B)，梯度洗脱；体积流量1.0 mg/mL；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.1.4 图谱生成 取10批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，对照品、供试品溶液典型色谱图分别见图1～2。将特征图谱(图3)数据导入国家药典委员会“中药特征图谱相似度评价系统(2012A)”软件，经校正，图谱自动匹配后生成对照图谱，确定并指认出11个特征峰。

2.1.5 方法学考察 取供试品溶液适量，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定5次，测得各特征峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。平行制备6份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测定各特征峰相对保留时间、相对峰面积RSD均在小于3%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得各特征峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

表2 工艺数值分类结果

从特征图谱的模糊性出发，I1可用于分类鉴别，其数值越接近，工艺越相似，表2显示，以3.39为阈值，工艺路线A、B的I1在3.39～3.58范围内，归为ⅠA类；工艺路线C、D的I1在3.06～3.37范围内，归为ⅡA类，表明这2类在氨基酸成分组成上具有差异。I2可于品质优劣比较，其绝对值越高，质量越好，表2显示，不同工艺I2依次为工艺路线D>工艺路线C>工艺路线B>工艺路线A，即工艺路线D最佳，工艺路线A最差；工艺路线A、B得分差异较大，表明两者氨基酸含量明显不同；工艺路线C、D得分接近，表明后者虽然优于前者，但优化效果不明显。

2.1.7 主成分分析 将10批样品中蒜氨酸、精氨酸、SAC、谷氨酰胺峰面积进行标准化处理后，采用SPSS 21.0软件进行主成分分析，计算其特征值、方差贡献率。结果，特征值分别为2.269、1.049，其中第一主成分F1=0.434X1-0.242X2+0.564X3+0.187X4，方差贡献率为56.73%，主要反映蒜氨酸、SAC含硫氨基酸在化学质量上的信息；第二主成分F2=0.113X1+0.715X2-0.332X3+0.400X4，方差贡献率为26.22%，主要反映精氨酸、谷氨酰胺在化学质量上的信息，可知前2个主成分累积贡献率达82.95%，基本保留原有变量的全部信息。再计算综合评分F，公式为F=(56.73F1+26.22F2)/82.95，结果见表3，由于综合评分越高，质量越好，可知工艺路线D为最佳工艺。

表3 主成分得分及排序

以第1主成分为横坐标，第2主成分为纵坐标绘制散点图，见图4。由此可知，工艺分为3类，工艺路线A、B为Ⅰ类，工艺路线C为Ⅱ类，工艺路线D为Ⅲ类，进一步验证了各工艺下提取物中氨基酸含量有明显差异。另外，与数值分类法比较，该方法未将工艺路线C、D归为一类，可能是由于前者对样品进行归类时只提取保留时间信息未提取峰面积信息，表明ⅡB类、Ⅲ类虽然氨基酸成分组成一致，但含量有所差异。

2.2 其他氨基酸总量测定 精密称取100 mg提取物至10 mL量瓶中，按“2.1.2”项下方法衍生化处理，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表4。由此可知，该类成分总含量在4.42%～11.59%范围内，其中精氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺含量较高，约占62%～84%。

表4 有效成分含量及CRITIC评分测定结果

2.3 蒜氨酸含量测定 结果见表4。

2.3.1 色谱条件 参照文献[13]报道，Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.04%三氟乙酸；柱温35 ℃；检测波长214 nm；进样量10 μL。

2.3.2 线性关系考察 将蒜氨酸对照品贮备液依次稀释至26.3、52.6、105.20、157.86、210.48、263.10 μg/mL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=16 704X-1 724(r=0.999 9)，在26.3～263.1 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 总糖含量测定 采用硫酸-蒽酮法，以葡萄糖质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=0.009 3X+0.067 5(r=0.996 2)，在3.4～20.4 μg/mL范围内线性关系良好，结果见表4。

2.5 TLC鉴别 参考文献[14]报道，以冰乙酸-氯仿-水(21∶18∶4)为展开系统，果糖、蔗糖、棉子糖为对照，展开后喷苯胺-二苯胺显色，在白光下检视，结果见图5。由此可知，除工艺路线D外其他工艺路线下提取物均含有果糖，无蔗糖、棉子糖，并且根据比移值和糖性质，可能还含有三糖和四糖，表明工艺路线D中低聚糖成分降低。

为了消除各指标量纲不同对贡献率的影响，需要对各指标的数据值进行无量纲标准化处理，公式为V标准化=(∣V给药-V模型∣)/V模型。

根据前期报道的蒜氨酸、大蒜多糖对化学性肝损伤中IFN-γ、AST、ALT、肝脏指数与脾脏指数变化[14]，构建CRITIC权重模型评价蒜氨酸和多糖分别对化学性肝损伤的保护作用。先对数据进行标准化，再计算IFN-γ、AST、ALT、肝脏指数、脾脏指数权重系数，分别为0.129 3、0.294 3、0.072 2、0.341 7、0.162 6，再根据综合权重与各指标标准效应值计算综合加权效应值，结果见表5，可知大蒜多糖、蒜氨酸药效贡献率分别为47.57%、52.42%。

表5 各指标效应值测定结果

由于不同有效成分有效剂量差异较大，故采用有效成分药效贡献率评价提取工艺时需考虑有效剂量。大蒜多糖、蒜氨酸给药剂量分别为82、17.5 mg/kg，其单位剂量药效贡献率分别为0.58%、3.00%。因此，两者评价提取工艺各自药效贡献率分别为16.20%、83.68%。

2.7 结果分析 蒜氨酸含量与其他氨基酸总量呈正相关，与总糖含量呈负相关。工艺路线A～C下提取物单糖、低聚糖成分组成相同，可知总糖是上述3种工艺下大蒜多糖药效贡献值差异大的原因，并且在提取过程中可能损失最多；工艺路线D中未鉴别出低聚糖等成分，可知单糖、低聚糖是该工艺与其他工艺下提取物大蒜多糖药效贡献值差异大的原因。

通过CRITIC权重法计算蒜氨酸、大蒜多糖对保护肝脏方面的药效贡献率，并将其代入工艺评价体系。结果，工艺路线D仍为最佳工艺，工艺路线C与该工艺下提取物总糖含量相差21%，但CRITIC评分相近，这是后者蒜氨酸含量达21.01%，而该成分为保护肝脏最主要的有效物质。

3 讨论与结论

本实验对不同提取工艺下蒜氨酸提取物工艺评价模式进行初步探索，先采用特征图谱对氨基酸成分进行整体表征，将氨基酸、多糖含量测定作为局部表征，为了更全面准确地评价工艺，首次采用CRITIC权重法计算蒜氨酸、多糖对化学性肝损伤保护作用的药效贡献率，以综合药效为指标。再采用数值分类法、主成分分析对特征图谱进行分析，其中前者是对全谱图中的所有峰进行全面提取并分析，保留了色谱全部信息，可更加直观地对不同工艺提取物进行定性和定量评价，尤其适合有效成分指认较少的特征图谱质量评价；后者对多个指标进行综合和简化后构建质量评价模型，是目前最常用的统计方法，除了可对全谱图进行分析外，还能对特定目标成分进行评价，结果显示，2种数模评价结果一致，表明两者构建的不同提取工艺下蒜氨酸提取物中氨基酸质量评价模型可行。

多糖约占大蒜干重的70%，但质量分数高的成分未必有更强的活性效应，前期发现蒜氨酸虽然占比低，但具有更高的药理活性，并且该成分与多糖在体内协同作用过程中的各自量效关系难以确定。本实验首次采用CRITIC权重法，将药效贡献率代入工艺评价系统中，对不同工艺进行评分，结果与以氨基酸为指标的数值分类法和主成分分析一致，均以工艺路线D最佳。

综上所述，本实验建立的多组分数学模型结合CRITIC药效模型可为蒜氨酸提取物质量评价提供依据。