川乌中1个新的乌头碱类二萜生物碱

马 莉， 李新亮， 史丹丹， 冷雪娇， 李存玉,2， 郑云枫,2， 彭国平,2*

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

川乌始载于《神农本草经》，为毛莨科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，其味辛、苦，性热，有大毒，具有祛风除湿、温经止痛的功效[1]，其化学成分主要为乌头碱类二萜生物碱，也是主要药效物质基础。现代药理研究表明，乌头碱型生物碱酯键的数量决定化合物毒性强弱，双酯型毒性最强，在生川乌中含量最高[2-6]，主要分布在循环系统，具有很强的抗炎、消肿及镇痛作用，但易导致各种心律失常的心脏毒性，从而限制了对单酯型及醇胺型乌头碱类二萜生物碱的开发应用。为了降低川乌中乌头碱类双酯型生物碱的毒性，探索相关药物应用的可能性，本实验通过碱水解让酯键水解，分离得到3种乌头碱类二萜生物碱，其中1个为新化合物。

1 材料

MicroTOF-Q质谱仪、ASR-500核磁共振仪，购自德国Bruker公司；Waters e2695高效液相色谱仪，购自美国Waters公司；Thermo Nicolet IR100红外光谱仪，购自美国Thermo公司；制备色谱柱Hedera ODS-2 C18(10 mm×250 mm，5 μm)；ELSD 6000蒸发光散射检测器，购自美国Auter公司；R-114旋转蒸发仪，购自瑞士Buchi公司；MS-105DU电子天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司；LGJ18-D真空冷冻干燥机，购自上海舜制仪器制造有限公司。

氘代吡啶，购自上海凛恩科技发展有限公司；尼奥灵(批号JBZ-0866，纯度大于98.0%)，购自南京金益柏生物技术有限公司；AB-8大孔树脂，购自上海麦克林生化科技有限公司；三氟乙酸、乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

川乌购自亳州，经南京中医药大学严辉教授鉴定为为毛莨科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根。

2 提取与分离

取鲜川乌切片15 kg，加氢氧化钙250 g，置于煎煮锅中加热煎煮2次，第1次加水40 L，加热煎煮1 h，滤出药液；第2次加水35 L，加热煎煮30 min，滤出药液，合并2次滤液，静置6 h，冷却至50 ℃，上清液过滤。取2.5 L已预处理AB-8大孔树脂，装到层析柱中，水洗去除气泡，加入药液，待其流尽后用去离子水25 L洗脱去除无机物，依次用15%乙醇、0.1%甲酸、含0.1%甲酸的15%乙醇各10 L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，冷冻干燥，得总乌头原碱，用80%乙醇溶解，经制备液相[色谱条件为流动相乙腈(A)-0.2%三氟乙酸(B)，梯度洗脱(0～50 min，11% ～21%A)；体积流量5.0 mL/min；柱温30 ℃。ELSD检测器气体体积流量2.8 L/min；漂移管温度110 ℃]，收集液回收溶剂至少量，冷冻干燥，得化合物1(75 mg)、2(20 mg)、3(15 mg)(保留时间分别为23.6、17.8、30.8 min)。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，改良碘化铋钾试剂显色呈阳性；[α]20D=4°(c=0.1，MeOH)，紫外光谱(MeOH)下没有吸收，提示不具有α, β-不饱和系统。IR光谱显示羟基(3 527 cm-1)的特征吸收。高分辨质谱检测可见准分子离子峰m/z:438.282 9 [M+H]+(计算值为438.285 5)，确定分子式为C24H39NO6，不饱和度为6。此外，在质谱图中还可观察到m/z:420.272 5[M+H-H2O]+、388.246 6[M+H-CH3OH-H2O]+、356.221 0[M+H-2CH3OH-H2O]+等碎片离子峰，符合乌头碱质谱裂解规律[7-11]。

在1H-NMR谱中，δH4.17 (1H, s)、4.45 (1H, d)分别给出2个可能为连氧碳上的质子信号，δH3.27 (3H, s)、 3.30 (3H, s)、3.46 (3H, s)分别给出3个单峰甲基信号，δH1.30 (3H，t，J=14.3 Hz)为氮乙基中甲基(N-CH2-CH3)质子信号；在13C-NMR谱中，给出24个碳信号，其中δC58.8、55.7、57.9处分别给出可能为3个连氧的甲基信号，δC70.8、74.1、75.2处分别给出3个连羟基信号，具体见表1。由HMBC谱可知，H-1(δ4.17)与C-3(δ28.2)、C-10(δ44.1)相关，H-5(δ2.26)与C-18(δ79.0)、C-17(δ64.2)、C-19(δ57.8)、C-7(δ53.8)、C-10(δ44.1)、C-4(δ38.2)、C-11(δ50.3)相关，H-6(δ4.47)与C-4(δ38.2)、C-8(δ74.1)、C-17(δ64.2)相关，H-7(δ2.48)与C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-9(δ48.0)、C-11(δ50.3)、C-15(δ41.9)、C-17(δ64.2)相关，H-9(δ2.38)与C-8(δ74.1)、C-13(δ41.1)相关，H-15(δ2.86, 2.50)与C-7(δ53.8)、C-13(δ41.1)、C-16(δ82.7)相关，H-16(δ3.54)与C-14(δ75.2)、C-23(δ55.7)、C-12(δ30.8)相关，H-17(δ3.55)与C-6(δ82.4)、C-8(δ74.1)、C-19(δ57.8)、C-11(δ50.3)、C-5(δ43.4)相关，H-18(δ3.48, 3.52)与C-3(δ28.2)、C-4(δ38.2)、C-5(δ43.4)、C-19(δ57.8)相关，H-19(δ3.37, 3.24)与C-3(δ28.2)、C-5(δ43.4)、C-7(δ53.8)、C-8(δ74.1)相关，18-OCH3(δ3.27)与C-18(δ79.0)相关，16-OCH3(δ3.30)与C-16(δ82.7)相关，6-OCH3(δ3.46)与C-6(δ82.4)相关，δH1.30(3H)与氮上亚甲基碳(N-CH2-CH3)相关，平面结构见图1，再以HMBC、H-H COSY谱进行验证，见图2。

表1 化合物11H-NMR、13C-NMR数据

查阅文献[12-15]可知，爱可宁平面结构与尼奥宁相同，两者1H-NMR(C5D5N，500 MHz)、13C-NMR(C5D5N，125 MHz)数据见表2，可知存在明显差异，故推测化合物1可能为尼奥宁的手性异构体，与后者结构区别为1-位羟基的手性差异。

表2 爱可宁、尼奥宁1H-NMR、13C-NMR数据

从分子模型分析，由于1-位羟基处于低能态的平伏键(e)键，此时1位氢处于直立键，成单峰，A环发生从船式构型转变成椅式构型的改变，从而使A环以及与A环连接碳上的质子位移发生变化，此时1位氢处于直立键，仍然成单峰，见图3。

由此可知，A环质子H-1、H-2、H-3，A环邻碳上质子H-6、H-10、H-17、H-18、H-19，以及空间阻碍的相关质子H-20、H-21均明显发生位移，特别是H-1明显向低场移动(δH4.17～4.45)，H-17明显向高场移动(δH3.55～2.93)；H-18中2个氢化学位移相近，使dd峰重叠成δH3.50位置的t峰，而立体异构化后差异变大，其中1个氢明显向低场移动至δH3.69，另1个为δH3.42，各呈d峰；H-19中2个氢有1个从δH3.37移至δH2.84，另1个从δH3.24移至δH2.39，即均明显向高场移动，两者之间差值增大；N乙基上的质子非常明显，亚甲基向低场移动，而甲基从δH1.30移动至δH1.01，即明显向高场移动。因此，H-1、H-17、H-18中2个氢、H-19中2个氢、N乙基上的甲基质子(H-21)可作为A环立体异构体鉴定的特征，见表3。

表3 1-羟基立体异构的氢谱特征

化合物1为乌头碱结构转化而来，从1-甲氧基的水解反应机理来分析，其1-位手性在 -OH进攻时从手性另一侧进攻，会发生手性反转的变化。另外，NOESY谱可进一步确证立体构型，其中H-1和H-12、H-6和H-9/H-18、H-16和H-13/H-7、H-17和H-12/H-3、H-18和H-5/H-21、N-CH2-CH3和H-18/18-OCH3之间有NOE效应。

采用多频率位移激发双梯度自旋回波1D NOESY对尼奥灵和化合物1的构型差别进行辨认[16-18]，发现两者H-17与H-1的空间取向不同，故通过选择激发H-17来观测H-1的NOE实验很容易鉴别这2种差向异构体。化合物1的H-1与H-17是同向，有NOE效应，而尼奥灵两者是反向，无NOE效应，故前者是后者1-位羟基的手性异构体，将其命名为爱可宁，为首个鉴定出的乌头碱类1-α-OH化合物，见图4。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z:358[M+H]+，分子式C22H31NO3。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：5.51、5.48(brs，1H，H-17)，4.68(s，1H，H-15)，1.21(t,J=14.3 Hz，3H，-NCH2CH3)，0.68(s，3H，18-CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：69.3(C-1)，31.7(C-2)，37.5(C-3)，34.8(C-4)，48.9(C-5)，22.8(C-6)，44.1(C-7)，49.1(C-8)，37.0(C-9)，52.9(C-10)，38.7(C-11)，209.0(C-12)，54.5(C-13)，31.1(C-14)，76.7(C-15)，151.7(C-16)，110.9(C-17)，25.5(C-18)，57.0(C-19)，65.4(C-20)，52.5(C-21)，11.7(C-22)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定为宋果灵。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z:422[M+H]+，分子式C24H39NO5。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：3.27，3.26，3.20(s，3H，-OCH3×3)，1.28(t，J=12.5 Hz，3H，-NCH2CH3)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：83.0(C-1)，25.2(C-2)，29.7(C-3)，38.1(C-4)，34.5(C-5)，22.6(C-6)，41.4(C-7)，73.8(C-8)，47.0(C-9)，46.4(C-10)，49.3(C-11)，28.2(C-12)，45.1(C-13)，75.1(C-14)，40.6(C-15)，82.7(C-16)，62.5(C-17)，78.4(C-18)，51.4(C-19)，49.4(C-20)，11.5(C-21)，55.4(C-22)，55.8(C-23)，58.9(C-24)。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定为塔拉乌头胺。