研究RH（D）阴性冰冻解冻红细胞的制备及临床意义

肖明星 丁璇 陈婷

（广东省潮州市中心血站 潮州 521000）

ABO 血型为临床输血工作中最为重要的血型，RH 血型为人类第二大血型系统，其临床价值均较高[1～2]。我国居民的RH（D）阴性血型比例大约为0.2%～0.5%，故稀有血型患者紧急用血需求常难以得到充分满足，RH（D）阴性血的收集供应与临床需求，或供不应求，或供过于求，整体表现为不均衡的现象，无任何规律，这就给采供血与输血抢救工作带来极大程度的困难[3～4]。为了提高RH（D）阴性血液的保存技术，临床以复方甘油配方深低温保存红细胞，解冻后运用不同浓度梯度的氯化钠溶液洗涤红细胞去除甘油成功[5～6]。该手段使得RH（D）阴性血液可长期保存，自采血之日起可保留10 年，有效满足RH（D）阴性患者现用现供ABO 血型同型RH（D）阴性血液的需求，缓解RH（D）阴性血液收集供应与临床需求不均衡的问题。基于此，本血站在2021 年展开RH（D）阴性冰冻解冻红细胞的制备、保留与临床使用研究，旨在为临床提供更可靠的参考依据。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 血液来源 选取2021 年12 月至2022 年5 月无偿献血血液筛查出的RH（D）阴性血，按库存RH（D）阴性血的采集时间与库存量，对收集6 d 内的RH（D）阴性血液冰冻保留，于迫切需要临床供血时进行制作，供临床使用。

1.2 材料与仪器 材料：236 型去甘油耗材（美国Haemonetics 公司）；复方甘油溶液（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）；塑料血袋（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）；9%氯化钠溶液与0.9%氯化钠溶液。仪器：血液处理机（美国Haemonetics Corporation 公 司 ， 型 号 ：ACP215），-80℃超低温保存箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司），大容量成分离心机（美国贝克曼公司），无菌接合机（日本泰尔茂公司，型号：TSCD-Ⅱ）

1.3 操作方法 （1）冰冻红细胞：将采集6 d 内的RH（D）阴性血液以离心力2 500 g 进行12 min 的离心处理，设定温度为4℃，去除上清液后获得约200 ml 的红细胞；之后将其转移到专用一次性使用塑料血袋内，将盛有红细胞的塑料袋放于振荡器上（频率200 次/min）；开启振荡器加甘油，缓慢加速，于0.5 h 内将320 ml 甘油加完，待室内环境达到稳定0.5 h之后贴标签进行包装，之后平放于-80℃冰箱进行保存。（2）解冻红细胞：将贮存在-80℃冰箱中的血袋取出（切忌勿弄坏血袋），放在37～40℃水浴箱内进行水浴加热解冻；轻轻震动，促使其快速融化，一直到冰冻红细胞全部解冻完成；解冻过后从水浴箱内取出融化的红细胞，擦拭干净，仔细观看血袋是否存在损坏现象；检查需保障所用的236 型去甘油耗材包装无裂缝或漏洞，且处在有效期中，拆开单包装，肉眼检查是否存在管路扭结、部件缺损等影响正常操作的状况，排除上述状况后用无菌接合机将解冻红细胞、236 型去甘油耗材的红色管路无菌接合，夹紧耗材上的全部滑动夹，将236 耗材的红细胞成品袋悬挂在ACP215 型血液处理机前面板左侧的小袋钉上，严格依据ACP215 型血液处理机的时机应用操作规范对去甘油耗材进行装配，核对精准无误差之后依次启动不同按钮，机器提示开始自动化去甘油与洗涤步骤；洗涤完毕后，确认废液上清液颜色无明显溶血现象，按下确定键，此时机体暂停使用，由盐水清洗之后的添加液悬浮红细胞转换至洗涤红细胞袋中；产品转移完毕后，关闭所有的阀，并将产品信息输入电脑中，贴上标签，送交至储血发血科。

1.4 观察指标 （1）质控抽检检测结果：质控科分次对24 U 去甘油洗涤后悬浮RH（D）阴性红细胞进行抽检，将血红蛋白含量、游离血红蛋白含量、白细胞残留量、甘油残留量、无菌试验与国家标准进行对比。用全自动血细胞分析仪[桂林优利特医疗电子有限公司，型号：URIT-3010，批准文号：桂食药监械（准）字2013 第2400004 号]检测血红蛋白含量与白细胞残留量。用邻-甲联苯胺法测定游离血红蛋白含量：取0.02 ml 上层血清，将其置放于检测管内，并将0.2 g/L 的标准血红蛋白放在标准管中，取3 支试管，分别标为空白管、标准管与测定管，之后取1.0 ml 邻-甲联苯胺与1 g/L 的过氧化钠溶液，放进3支试管内，完全混合后放置10 min；之后于3 支试管内放入10%乙酸溶液100 ml，进行435 nm 的比色，期间空白管归零，读取每个管内的吸光度，取得相应的血红蛋白含量，依据临床有关需求，解冻红细胞内的游离血红蛋白含量需＜1 g/L。用全自动细菌培养仪（碧迪公司，型号：BACTEC FX，批准文号：20162223234） 做无菌试验。甘油残留量：按GPO-PAP 法测定甘油三酯的标准，用三磷酸腺苷（ATP）、甘油激酶对甘油进行磷酸化，显色剂选用4-氯酚、4-氨基安替比林，以显色情况评估甘油含量（两者之间为正比关系）。实际测量方式如下：按照1:1 的比例将三氯醋酸放入洗涤完毕的红细胞悬液，之后于室温环境下放置10 min，以2 000 r/min 的速率离心处理10 min，取上清液进行测定；之后在空白管、标准管与测定管中放进蒸馏水、待测样本与标准甘油（均为0.02 ml），在各管中均放入2 ml 酶工作液，全部溶解后在37℃水浴中显色（8 min），以分光光度计、比色杯和红星管收集 OD 值。（2）记录 RH（D）阴性冰冻红细胞临床应用情况。

1.5 统计学分析 采用SPSS20.0 软件分析数据，计数资料用%表示，行χ2检验；计量资料用（）表示，行t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质控抽检检测结果 RH（D）阴性冰冻红细胞解冻之后，血红蛋白含量、游离血红蛋白含量、白细胞残留量、甘油残留量、无菌试验检测均符合国家标准。见表1。

表1 质控抽检检测结果

2.2 临床应用情况 2020 年5 月至2022 年5 月，经确证的RH（D）阴性血液1 822 U，除1 461.5 U 急用发出，共冷冻保存360.5 U，已供临床使用的冷冻解冻去甘油洗涤红细胞共290 U，保存时间为11～910 d。RH（D）阴性冰冻红细胞解冻之后通常用于手术、外伤、不同的血液疾病中，使用患者数共计80 例，少数患者用血量为4～6 U，大部分患者用血量为2～3 U；输注过后绝大多数患者血液中的血红蛋白水平明显升高，贫血状态得到有效改善；输血后均无输血反应，血压、呼吸、脉搏正常，无血红蛋白尿发生，临床应用效果确切。

3 讨论

输血治疗是临床抢救危重患者的重要手段。RH（D）阴性全血或悬浮红细胞常规2～6℃环境下可保存35～42 d，但RH（D）阴性血人群分布少，临床用血不稳定，经常出现该类血型供不应求、实际应用率低等局面[7～9]。因此，临床需探寻更为有效的方法保存RH（D）阴性红细胞，为病情危重的RH（D）阴性患者输血治疗提供良好的保障。

甘油存在无毒、中性等优势，可渗透到细胞内，与水的结合能力较强，且对细胞膜具有良好的保护效果，故临床可将甘油作为保护剂，长时间保留红细胞[10～12]。冰冻解冻去甘油红细胞是冰冻红细胞在溶解过后，洗涤清理大部分的甘油，同时将红细胞悬浮于相对量生理盐水内的红细胞成分血。冰冻红细胞是将从收集日至6 d 内的红细胞，同一定浓度和含量的甘油相互混合到40%浓度后，放于-80℃环境下冰冻制作完备，保存期间可长达10 年，多用于自身输血和稀有血型红细胞的保留，如ABO 型、孟买血型等，在该类稀有血型储存中意义重大，可有效解决稀有血型患者抢救性输血问题，及时挽救患者生命[13]。洗涤过后的红细胞虽然存有轻微的形态变化，然而不干扰其携氧、变形等能力。另外，该制品还适用于血浆蛋白过敏等患者中。

本研究结果显示，RH（D）阴性冰冻红细胞在解冻之后，血红蛋白含量、游离血红蛋白含量、白细胞残留量、甘油残留量、无菌试验等质控指标均符合国家标准；且2020 年5 月至2022 年5 月，经确证的RH（D）阴性血液 1 822 U，除 1 461.5 U 急用发出，共冷冻保存360.5 U，已供临床使用的冷冻解冻去甘油洗涤红细胞共290 U，保存时间为11～910 d。RH（D）阴性冰冻红细胞解冻之后通常用于手术、外伤、不同的血液疾病中，使用患者数共计80 例，少数患者用血量为4～6 U，大部分患者用血量为2～3 U；输注过后绝大多数患者血液中的血红蛋白水平明显升高，贫血状态得到有效改善；输血后均无输血反应，血压、呼吸、脉搏正常，无血红蛋白尿发生，临床应用效果确切。表明RH（D）阴性冰冻红细胞解冻之后可在临床输血抢救中获得满意效果。

同种异体冰冻红细胞在制备时，白细胞、细胞外钾离子等较多的物质经反复多次洗涤被吸取，减少了因输注异体血而诱发的输血免疫反应发生率和与白细胞有关病毒的传播率，从而有效保障输血安全。同时，稀有血型血液被采集后进行甘油化深低温保存，使用时运用ACP215 型血液处理机进行RH（D）阴性冰冻解冻红细胞的制备过程仅需1.5～2.0 h，可随时制备，及时为临床提供急需血液，一方面为患者争取抢救时间，另一方面可有效缓解临床稀有血型紧缺的压力[14]。在具体操作中，临床还需注意如下几点：（1）血液在4℃冰箱中保存，其氧气释放能力会伴随时间的推移而呈逐渐下降，进而增加溶血的可能性，临床需选择6 d 以内的血液进行冰冻保存；（2）在血液冰冻时期，其外部需添加纸盒，避免储存期间断裂导致血液报废[15]；（3）手工制作浓缩红细胞时可行倒置离心处置，将其转换至无菌血袋时可将白膜层留放于原本的血袋内；（4）手工洗涤时，必须于无菌室百级净化台上进行操作，且需严格按照无菌操作，保证血液的安全性；（5）洗涤红细胞制品时经过较多次的开放，被细菌污染的风险高，加之用生理盐水悬浮，红细胞保存缺乏营养，故需于24 h 内尽早输注，确保输血安全。

综上所述，使用ACP215 型血液处理机制备的RH（D）阴性冰冻红细胞在临床急救时可快速解冻制备，为急诊抢救患者提供珍贵的血源，临床应用价值较高。