miR-146a-5p靶向调控Notch2促进人晶状体上皮细胞线粒体损伤诱导的细胞凋亡

武彬，丁雨溪，王静，夏建平，马立威，张劲松

（爱尔卓越眼科医院眼科，沈阳 110003）

随着人口老龄化的日益严重，白内障的发生率逐年递增，已经成为影响老年人健康的严重问题［1］。白内障的发生、发展机制复杂，与多种生理进程密切相关，还与周围环境暴露和表观遗传有关［1］。微RNA（microRNA，miRNA）对基因表达的调控是一种表观遗传调控机制。miRNA是短片段的非编码RNA序列，长度约为20～22个碱基序列。研究［2］报道，晶状体和白内障晶状体样本的中央上皮的miRNA表达谱不同，表明不同表达的miRNA可能在晶状体发育和白内障发生中发挥作用。

miR-146a-5p是miR-146家族的成员，miR-146a是最新研究热点之一，在多个物种中高度保守，人miR-146a位于5号染色体LOC285628基因的第2个外显子上［3］。miR-146a-5p主要参与调控细胞的增殖、凋亡、分化和细胞发育［4-6］。胃癌、肺癌和前列腺癌中，miR-146a-5p水平低于癌旁组织。miR-146-5p可以调控食管鳞状细胞上皮-间质转化，通过直接与Notch2的3’非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）靶向结合，抑制Notch2的表达，从而发挥作用［7］。然而，关于miR-146a-5p在年龄相关性白内障中作用的研究很少。本研究探讨了miR-146a-5p对人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cell，HLEC）凋亡的调控作用，采用实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测白内障患者晶状体上皮组织中miR-146a-5p的表达，确定miR-146a-5p为潜在的疾病生物标志物；建立体外细胞模型，通过过表达miR-146a-5p，探讨其对细胞凋亡的影响以及线粒体相关蛋白的变化；并进一步验证miR-146a-5p对Notch2 3’-UTR的靶向调控作用，以及miR-146a-5p对Notch2下游蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采集2018年12月至2020年10月间我院收治的白内障患者的晶状体上皮样本，通过完整的连续环形撕囊术获得晶状体上皮。所有患者均接受完整的术前眼科检查，除年龄相关性白内障外无其他眼部疾病。根据晶状体混浊分级系统Ⅲ的修订版本，对白内障的类型和严重程度进行分级和记录。选择CN 4～6分、C 4～5分和P 4～5分（C，皮质性混浊；N，晶状体核混浊；P，后囊下性混浊）的15例患者晶状体为白内障组，患者年龄60～70岁，其中男8例，女7例。收集我院眼科眼库新鲜人眼晶状体上皮样本15例为对照组，患者年龄55～65岁，其中男9例，女6例。本研究通过我院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 qRT-PCR

采用qRT-PCR检测组织或细胞中miR-146a-5p的表达水平。应用miRNeasy试剂盒（德国QIAGEN公司）从总RNA中分离miRNA，并应用1 μg RNA和Prime Script RT试剂盒（日本TaKaRa公司）进行反转录，以U6为内参。使用SYBR Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）对特定产物进行3次扩增和检测，并对数据进行分析。PCR反应条件：95 ℃预变性反应 15 min，94℃变性反应 15 s，55 ℃退火反应 30 s，70 ℃延伸反应30 s，40 个循环反应。

采用qRT-PCR检测NDUFS8、SDHb、COX5b、ATP5a1mRNA的表达水平，以β-actin为内参，TRIzol法提取RNA后，反转录为cDNA。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95 ℃变性反应 5 s，56 ℃退火反应30 s，72 ℃延伸反应 30 s，40 个循环反应。应用2-ΔΔCt法计算各组间mRNA的相对表达水平。

1.3 细胞培养和转染

HLEC细胞系SRA01/04购自美国ATCC公司。在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2条件下培养。将miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC（中国上海生工股份有限公司）转染到细胞中，采用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染，转染24 h后采用qRT-PCR检测miR-146a-5p水平。

1.4 细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（美国eBioscience公司），将转染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC的细胞在转染后48 h进行细胞凋亡检测。按照试剂盒说明书，将转染48 h后的SRA01/04细胞1 000g离心10 min，用预冷的PBS清洗，并重新悬浮在250 μL结合缓冲液中。将细胞与Annexin V-FITC和PI在室温下黑暗中孵育15 min，随后用流式细胞仪（美国BD 公司）进行分析。采用ImageJ软件分析细胞凋亡情况。

1.5 Western blotting检测

将消化后的SRA01/04细胞在放射免疫沉淀法裂解缓冲液中4 ℃裂解30 min。使用线粒体分离试剂盒（美国赛默飞公司）分离线粒体，蛋白定量、蛋白变性后，取30 μg蛋白在10%SDS-PAGE中分离，然后转移到PVDF膜上，4 ℃下与caspase 9、caspase 12、细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、Notch2、Hey1、GAPDH抗体孵育过夜；与HRP标记的二抗结合后，采用ECL Plus化学发光试剂盒（美国GE医疗公司）检测，采用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.6 活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测

将转染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5pNC的胞，使用2’，7’-二氯二氢荧光素-二乙酸酯（DCFH-DA，美国Sigma公司）对细胞产生的ROS进行定量。细胞与10.0 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵化30 min。采用荧光电镜观察细胞内荧光强度变化，拍照后，采用ImageJ软件计算ROS水平。

1.7 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验

采用TargetScan生物信息学网站（https：//www.targetscan.org/vert_42/）预 测miR-146a-5p 靶 点。采用双荧光素酶报告基因实验进行验证，用含有10%胎牛血清的DMEM培养HEK293T细胞。将Notch2mRNA的野生型3’-UTR片段以及含有预测miR-146a-5p结合序列或无预测序列的miR-NC结合序列的构建体克隆到psiCHECK2荧光素酶报告载体中（美国Promega公司），分别为Notch2 3’-UTR WT+miR-146a-5p组 和Notch2 3’-UTR WT+miR-NC组。携带Notch2mRNA的3’-UTR突变片段以及结合序列的miR-NC也被克隆到psiCHECK2荧光素酶报告载体中，分别为Notch2 3’-UTR MUT+miR-146a-5p组 和Notch2 3’-UTR MUT+miR-NC组。将HEK293T细胞接种在24孔板中，用FuGENE 6（美国Promega公司）与10 μmol/L miR-146a-5p或miR-NC和2.5 μg psiCHECK2载体共同转染，该载体含有Notch2 3’-UTR的突变或野生预测片段。扩增子被插入到荧光素酶报告基因的cDNA下游载体中。转染48 h后，使用双荧光素酶报告系统（美国Promega公司），自动微孔板测定仪测量相对荧光素酶表达，并计算活性值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-146a-5p在白内障患者晶状体上皮中表达上调

与对照组相比，白内障组miR-146a-5p表达明显上调（P＜ 0.05），见图1。

图1 qRT-PCR检测白内障组和对照组晶状体上皮中miR-146a-5p的表达Fig.1 Expression of miR-146a-5p in lens epithelial samples of cataract patients and control subjects detected by qRT-PCR

2.2 miR-146a-5p促进SRA01/04细胞的凋亡

qRT-PCR结果（图2A）显示，miR-146a-5p mimics转染SRA01/04细胞后，miR-145a-5p处于过表达状态。Annexin V和PI双染色结果（图2B）显示，miR-146a-5p过表达增加了SRA01/04细胞的早期和晚期凋亡水平。检测转染后细胞中caspase 9和caspase 12表达的变化，结果（图2C）显示，与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组细胞中caspase 9表达水平显著增高（P＜ 0.05），但caspase 12表达变化的差异无统计学意义（P＞ 0.05）。上述结果表明，线粒体功能紊乱是miR-146a-5p调控的第一步，通过caspase 9的激活引发miR-146a-5p诱导的细胞凋亡。

图2 miR-146a-5p模拟物促进SRA01/04细胞凋亡Fig.2 miR-146a-5p mimics promotes apoptosis in lens epithelial SRA01/04 cells

2.3 miR-146a-5p通过诱导线粒体功能紊乱促进SRA01/04细胞凋亡

miR-146a-5p mimics转染SRA01/04细胞后，MMP-2和MMP-9表达均下调（图3A），表明miR-146a-5p mimics引发MMP蛋白破坏。进一步分离各组细胞中的线粒体和细胞质，Western blotting结果（图3B）显示，miR-146a-5p过表达导致Cyt c从线粒体转移到细胞质。miR-146a-5p NC或miR-146a-5p mimics转染SRA01/04细胞48 h后，qRT-PCR结果（图3C）显示，与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组细胞中NDUFS8、COX5b和ATP5a1mRNA的表达水平显著下调（P＜0.05），表明线粒体电子运输链被增强的miR-146a-5p表达阻断。同时免疫荧光结果（图3D）显示，与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组细胞中ROS水平下降。结果证实，miR-146a-5p过表达可能促进HLEC中ROS的释放，激活氧化应激反应。

图3 miR-146a-5p通过诱导线粒体功能紊乱促进SRA01/04细胞凋亡Fig.3 miR-146a-5p promotes the apoptosis of SRA01/04 cells by inducing mitochondrial dysfunction

2.4 Notch2是miR-146a-5p的功能靶点

TargetScan网站预测分析结果（图 4A）显示，Notch2 3’-UTR 中部分核苷酸序列能与 miR-146a-5p特异性互补配对。双荧光素酶报告基因实验（图4B）发现，与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组Notch2 3’-UTR WT载体的荧光素酶相对活性显著降低（P＜ 0.05），而Notch2 3’-UTR MUT 荧光素酶相对活性无统计学差异（P＞ 0.05），结果表明，miR-146a-5p NC不影响突变体构建中的荧光素酶活性。Western blotting结果（图4C）证实，与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组Notch2的表达明显下调（P＜ 0.05）。

图4 miR -146a-5p靶向结合Notch2的3’-UTR并下调Notch2的表达Fig.4 miR-146a-5p specifically targets the 3’-UTR of Notch2 and reduces its expression

2.5 miR-146a-5p对Notch2信号通路下游蛋白的影响

与miR-146a-5p NC组相比，miR-146a-5p mimics组SRA01/04细胞中Hey1蛋白表达明显下调（P＜ 0.05）。见图5。

图5 Western blotting检测Hey1蛋白的表达水平Fig.5 Expression of Hey1 protein detected by Western blotting

3 讨论

白内障是致盲的主要原因之一，与衰老过程密切相关。近期有研究报道，miR-146a-5p过表达能够激活前列腺癌［4］和非小细胞肺癌［3］细胞凋亡，并引发细胞周期阻滞。同时，miR-146a-5p通过靶向调控Notch2的水平，影响心肌缺血再灌注大鼠的心肌损伤［8］。此外，miR-146a在多种细胞和组织中调控慢性炎症反应［9］，而慢性炎症可诱发机体的氧化损伤、DNA损伤和干细胞衰老，这些均与加速衰老密切相关［10］。基于上述研究报道，本研究通过qRT-PCR发现，miR-146a在年龄相关性白内障晶状体上皮中表达上调。

大量研究［11］证实，多种因素与白内障的发生和发展密切相关，包括糖尿病、紫外线过量照射、不良药物使用和其他眼部疾病等。上述疾病因素中，氧化应激和由氧化应激产生的ROS被认为是白内障的主要易感因素。LI等［12］的研究表明，晶状体上皮细胞凋亡是哺乳动物非先天性白内障发生的特性表型。因此，本研究检测miR-146a-5p过表达的HLEC中的凋亡生物标志物和细胞功能，结果表明，miR-146a-5p通过线粒体功能障碍激活HLEC凋亡，包括阻断电子传递、形成ROS，进一步将Cyt c释放到细胞质中，并触发caspase 9激活。

为了鉴定miR-146a-5p的靶基因，本研究采用TargetScan靶预测工具，预测Notch2是miR-146a-5p的靶基因，并通过荧光素酶报告基因实验进一步验证了miR-146a-5p与Notch2的3’-UTR特异性结合，同时Western blotting结果证实miR-146a-5p与Notch2的表达呈负相关。1991年和1997年，WEINMASTER等［13］证实Notch受体分别在果蝇和发育中的大鼠眼睛中表达。对出生后大鼠晶状体上皮细胞分化进行的体外研究结果表明，在成纤维细胞生长因子依赖的次级纤维细胞分化过程中，Notch2信号被激活，但未检测到相应的Notch1激活。Notch2条件突变小鼠表现出严重的小眼畸形、纤维细胞形态破坏和白内障表型［14］。由此可见，Notch2突变和表达下调是白内障产生的主要原因之一。Hey1是Notch信号通路下游重要的调控蛋白，与胚胎血管形成有关［15］。本研究除发现miR-146a-5p抑制Notch2表达外，还发现Notch2下游的重要调控蛋白Hey1明显下调，进一步证实miR-146a-5p对Notch2信号通路的抑制作用。

综上所述，miR-146a-5p在白内障患者晶状体上皮组织中表达上调，其过表达能够促进HLEC凋亡，其作用机制与影响线粒体稳态和下调Notch2信号通路密切相关。