去甲氧基姜黄素通过促进海马神经发生对阿尔兹海默症认知损伤的改善作用

林凯莉， 张世卿

(1.广州医科大学公共卫生学院, 广东 广州 511436；2.香港浸会大学生物系，香港 九龙塘 999077)

阿尔兹海默症是最常见的神经退行性疾病，主要表现为认知及记忆损伤，尚缺乏有效的治疗药物。大脑海马区是调控认知和记忆功能的主要脑区，海马神经发生是指海马区神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化产生新生神经元的过程，最新研究发现成人也存在海马神经发生现象，但阿尔兹海默症患者的海马NSCs分化成为神经元的能力下降，导致神经发生水平被抑制[1]。因此，促进海马神经发生修复受损神经元是治疗阿尔兹海默症的有效策略[2]。中药姜黄是治疗阿尔兹海默症的常用药物，临床疗效显著[3]。去甲氧基姜黄素是姜黄的主要活性成分之一，具有一定的神经保护作用[4]，但其抗阿尔兹海默症作用还未明确。此外，姜黄素被证实可以通过促进NSCs分化产生新生神经元有效治疗小鼠阿尔兹海默症[5]，去甲氧基姜黄素作为姜黄素的天然衍生物之一，而关于其对NSCs的影响以及是否通过促进海马神经发生有效治疗阿尔兹海默症的研究机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨去甲氧基姜黄素对NSCs的影响以及其通过促进海马神经发生改善阿尔兹海默症的机制，以期为去甲氧基姜黄素作为抗阿尔兹海默症潜在治疗药物奠定实验基础。

1 材料

1.1 动物 新生1～2 d的SD大鼠购自香港中文大学；雄性APP/PS1双转基因小鼠及野生型(WT)SPF级小鼠购自广州中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2018-0034，在光照/黑暗12 h/12 h周期中自由活动饮食。

1.2 试剂与药物 去甲氧基姜黄素(批号24939-17-1，纯度99.43%)购自成都曼思特生物科技有限公司；DMSO(批号D4540)、β-actin抗体(批号A5316)购自美国Sigma公司；聚乙二醇(批号P103728)、吐温-80(批号T104866)购自上海阿拉丁生化科技有限公司；表皮生长因子(EGF，批号AF-100-15-100UG)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，批号AF-100-18B-100UG)、B27添加剂(批号17504-044)、青霉素-链霉素-新霉素溶液(批号15640-055)、神经基础培养基(批号21103-049)购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂(批号PH536)购自日本同仁公司；DAPI(批号10236276001)购自瑞士Roche公司；p-GSK-3β(Ser9) 抗体(批号5558S)、GSK-3β抗体(批号9315S)、β-catenin抗体(批号8814S)购自美国Cell Signaling Technology公司；巢蛋白(Nestin，批号MAB5326)、MAP2抗体(批号AB2290)、Sox2(批号AB5603)抗体购自美国EMD Millipore公司；BCA蛋白测定试剂盒(批号23227)购自美国Thermo公司；化学发光试剂盒(批号 TJA07)购自韩国AbFrontier公司；羊抗兔二抗(批号65-6120)、羊抗鼠二抗(批号62-6520)购自美国Invitrogen公司。

1.3 仪器 CO2培养箱(美国Shellab公司)；LABGARD生物安全柜(美国NuAire公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；电泳仪、ChemiDoc Touch化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)；水迷宫实验装置、Y迷宫实验装置(广州格物智源生物科技有限公司)；Pannoramic Desk Scanner数字切片扫描仪及CaseViewer软件(匈牙利3DHISTECH公司)。

2 方法

2.1 原代NSCs培养 参考文献[6]报道培养原代NSCs。新生1～2 d的SD大鼠快速取脑，分离室下区组织并浸泡在冰Hank’s平衡盐溶液中，切块后用胰蛋白酶在37 ℃下消化15 min，将组织悬液用40 μm细胞滤网过滤，滤液1 000 r/min离心5 min后弃上清液，将细胞重悬于含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、1%青霉素-链霉素-新霉素溶液和2% B27的神经基础培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2～3 d更换一半培养基，当神经球直径达到150～200 μm时进行传代。

2.2 NSCs增殖检测 NSCs接种于96孔板中，加入去甲氧基姜黄素(1.25、2.5、5 μmol/L)培养3 d后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于37 ℃培养箱中孵育2 h，酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值。

2.3 NSCs分化检测 将NSCs接种于铺有盖玻片的6孔板上，使用NSCs分化培养基(含1%青霉素-链霉素-新霉素溶液和2% B27的神经基础培养基)联合去甲氧基姜黄素(1.25、2.5、5 μmol/L)诱导NSCs分化7 d后，通过Western blot实验检测NSCs分化标志物Nestin(NSCs标记物)和MAP2(神经元标记物)蛋白表达，分析NSCs的分化。

2.4 分组及给药 5月龄APP/PS1双转基因小鼠及WT小鼠随机分为对照组(WT小鼠)、模型组(APP/PS1小鼠)及去甲氧基姜黄素低、高剂量组(APP/PS1小鼠，2.5、5.0 mg/kg)，每组6只。去甲氧基姜黄素以混合溶剂(10% DMSO、40% 聚乙二醇300、5%吐温-80、45%生理盐水)溶解后，给药组小鼠进行腹腔注射，模型组、对照组小鼠腹腔注射等体积溶剂，每天1次，共28 d。行为学实验结束后，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉，手术刀切开前胸，暴露心脏，在心尖处插入输液针头，剪开右心房，用生理盐水灌注，待肝脏变白后，在冰上迅速断头并完整取出脑组织，每组取3个用于组织病理学检查，浸泡于固定液中48 h后石蜡包埋；再取3个，在-80 ℃下保存，用于Western blot检测。

2.5 行为学实验

2.5.1 水迷宫实验 参考文献[7]报道，水迷宫水池(直径120 cm)中充满水后被平均分为4个象限，隐蔽平台(直径10 cm)位于1个象限的中心水面下1 cm处。水迷宫实验包括训练和探索实验2个阶段，训练阶段每只小鼠随机释放在4个象限，若未能在60 s内找到平台，则将其引导找到平台并允许其停留10 s，每只训练5 d(每天连续4次，间隔10 min)。探索实验时撤除平台，允许每只小鼠探索60 s，记录在目标象限所用时间、运动距离、通过平台位置次数。

2.5.2 Y迷宫实验 参考文献[7]报道，Y迷宫由3个臂(长30 cm、宽7 cm、高15 cm)组成，夹角120°。在训练阶段，新异臂被阻挡，允许小鼠自由探索另2只臂(起始臂和其他臂)5 min，小鼠被送回笼子1 h后打开3个臂，再放入起始臂并使其自由探索3 min，记录进入新异臂的距离、时间和次数。

2.6 Western blot检测Nestin、MAP2、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin蛋白表达 使用蛋白提取试剂从各组细胞或海马组织匀浆中提取蛋白，BCA法进行蛋白定量检测。取30 μg蛋白，在10% SDS-PAGE胶进行电泳分离，并转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Nestin、MAP2、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β和β-catenin(1∶1 000)一抗，在4 ℃下孵育过夜，洗膜后加入特异性二抗常温孵育1 h，以β-actin为内参蛋白。采用化学发光试剂进行显色，通过ChemiDoc Touch化学发光成像系统拍照，Image J软件分析目的蛋白相对表达量。

2.7 Nissl染色 石蜡包埋的小鼠脑组织进行冠状切片(5 μm)，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，常规甲苯胺蓝Nissl染色液染色，中性树脂封片。封片后，采用数字切片扫描仪、CaseViewer软件对海马区进行扫描分析，计算海马CA1、CA3、DG区域中Nissl+细胞数。

2.8 组织免疫荧光染色 脑组织石蜡切片脱蜡脱水后，加入Sox2一抗(NSCs标记物)，在4 ℃下孵育过夜，再用带荧光素标记的二抗在室温下孵育3 h，DAPI(1 μg/mL)复染细胞核。封片后，采用数字切片扫描仪、CaseViewer软件对海马区进行扫描分析，计算每个随机视野中Sox2+细胞数。

3 结果

3.1 去甲氧基姜黄素促进NSCs增殖 如图1所示，去甲氧基姜黄素可剂量依赖性地增加NSCs存活率(P<0.05，P<0.01)，并且浓度在2.5 μmol/L时最高，表明该成分可促进NSCs在体外的增殖。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 去甲氧基姜黄素促进NSCs分化 如图2所示，去甲氧基姜黄素可剂量依赖性地降低Nestin蛋白表达(P<0.01)，升高MAP2蛋白表达(P<0.01)，表明该成分可促进NSCs往神经元方向的分化。

注：A为NSCs分化蛋白条带，B为蛋白定量分析。与对照组比较，**P<0.01。

3.3 去甲氧基姜黄素激活NSCs中GSK-3β/β-catenin通路 GSK-3β通过Ser9处的磷酸化使GSK-3β失活并激活GSK-3β/β-catenin通路，是促进NSCs增殖和分化的主要通路之一[6]。如图3所示，去甲氧基姜黄素能剂量依赖性地提高NSCs中p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin/β-actin蛋白表达比值(P<0.05，P<0.01)，激活GSK-3β/β-catenin通路，表明该成分介导的NSCs增殖和分化可能通过抑制GSK-3β活性来激活GSK-3β/β-catenin通路。

3.4 去甲氧基姜黄素改善APP/PS1小鼠的认知损伤状态 水迷宫实验平台设置如图4A所示。在训练阶段，与对照组比较，模型组小鼠寻找平台所需时间增长(P<0.01)；与模型组比较，去甲氧基姜黄素组小鼠寻找平台所需时间缩短(P<0.05，P<0.01)(图4B)。在移除平台后，与模型组比较，去甲氧基姜黄素组小鼠在目标象限停留时间增长(P<0.05，P<0.01)(图4C)，穿越平台次数增加(P<0.05)(图4D)。

Y迷宫实验3臂设置如图4E所示。与模型组比较，去甲氧基姜黄素组小鼠在新异臂中停留时间(图4F)及运动距离(图4G)都均增加(P<0.05)，而进入新异臂的次数有增加的趋势，但差异无统计学意义(图4H)，表明该成分可改善APP/PS1小鼠的认知损伤状态。

3.5 去甲氧基姜黄素促进APP/PS1小鼠的海马神经发生 如图5～6所示，与对照组比较，模型组小鼠海马各区域Nissl+细胞比例均减少(P<0.05，P<0.01)，海马DG区中Sox2+细胞数减少(P<0.01)；与模型组比较，去甲氧基姜黄素组小鼠海马区域中Nissl+细胞的比例增加(P<0.05)，海马DG区中Sox2+细胞数增加(P<0.01)，表明该成分可增强APP/PS1小鼠的海马神经发生水平。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

注：A为海马区Nissl染色(×400)，B为海马区Nissl+细胞相对数量。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

注：A为海马区免疫荧光染色(×400)，绿色为Sox2阳性，蓝色为细胞核，B为海马区Sox2+细胞数量。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。

注：A为GSK-3β/β-catenin通路蛋白条带，B为蛋白条带定量分析。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.6 去甲氧基姜黄素激活APP/PS1小鼠海马的GSK-3β/β-catenin通路 如图7所示，与对照组比较，模型组小鼠海马中GSK-3β/β-catenin通路的活性受到抑制(P<0.01)；与模型组比较，去甲氧基姜黄素组可上调海马中p-GSK-3β/GSK-3β和β-catenin/β-actin蛋白表达比值(P<0.05，P<0.01)，即GSK-3β/β-catenin通路被激活，表明该成分促进APP/PS1小鼠海马神经发生及改善认知损伤的作用可能依赖于GSK-3β/β-catenin通路的激活。

4 讨论

随着人口老龄化的快速发展，神经退行性疾病的发病率急剧上升[8]。2019年全球阿尔兹海默症患者已超过5 000万，而中国阿尔兹海默症患者接近1 000万，预计到2030年中国阿尔兹海默症患者将超过2 300万[9]。尽管目前药物研发取得巨大进展，但仍缺乏有效的治疗药物。阿尔兹海默症的致病原因复杂，但目前已发现的多种与阿尔兹海默症相关致病因素均与海马神经发生被抑制有关，包括淀粉样蛋白-β(Aβ)水平失调[10]、Tau蛋白异常酸化[11]、神经炎症[12]以及年龄[13]等。因此，促进海马下区NSCs分化产生新的神经元，增强成年海马神经生成可能是一种治疗阿尔兹海默症的策略[2]。然而，NSCs在正常情况下分化能力有限，必须在刺激物的诱导下才能促进其分化产生神经元[14]。最近的研究进展及本实验室以往的研究工作证明，利用外源基因或药物干预促进海马神经发生可以改善阿尔兹海默症小鼠的认知障碍[7,15]。

去甲氧基姜黄素作为姜黄素的天然衍生物，是中药姜黄的主要活性成分之一，但其抗阿尔兹海默症的作用效果及机制尚未清楚。有报道指出姜黄素可以通过抑制GSK-3β活性保护神经元抗Aβ引起的神经元毒性作用[16]。GSK-3β/β-catenin信号通路被认为是调控NSCs增殖和分化的关键通路，并在调控阿尔兹海默症患者海马神经发生中起着至关重要的作用[17]。课题组前期研究表明，利用中药活性小分子抑制GSK-3β活性激活GSK-3β/β-catenin通路可促进NSCs增殖，促使其分化为神经元[6]，并可以改善海马神经发生进而治疗阿尔兹海默症[7]，提示GSK-3β/β-catenin通路是药物的理想靶点。本研究也首次证实去甲氧基姜黄素可抑制GSK-3β活性激活GSK-3β/β-catenin通路，促进海马神经发生，发挥抗阿尔兹海默症的作用。此外，有研究利用分子对接技术发现去甲氧基姜黄素可以与GSK-3β蛋白紧密结合，提示去甲氧基姜黄素可能通过直接作用于GSK-3β蛋白抑制其活性[18]，但去甲氧基姜黄素的直接作用靶点是否为GSK-3β还有待进一步研究确定。

综上所述，本研究发现去甲氧基姜黄素可以促进神经干细胞在体外的增殖和分化产生神经元，并通过增强海马神经发生水平有效改善转基因阿尔兹海默症小鼠的认知障碍，该作用可能与其激活GSK-3β/β-catenin通路相关。利用中药活性成分促进海马神经发生可能是治疗阿尔兹海默症和其他神经退行性疾病的有效途径。