UHPLC⁃Q⁃Exactive Orbitrap MS 分析五味消毒饮中化学成分

董萍萍 张加余王红孙志强王笑代龙∗王少平∗

（1.滨州医学院， 山东 滨州264003； 2.山东中医药大学， 山东 济南250300； 3.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司， 山东 德州251200）

近年来国家对于经典名方发布了开发利用的具体政策，2019 年3 月出台的《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求公开征求意见》，要求所开发的经典名方与传统汤剂的物质基础需保持基本一致［1］。物质基准的研究对于经典名方的开发和利用至关重要。五味消毒饮出自《医宗金鉴》，具有清热解毒、消散疔疮的功效，主治各种疔毒、痈疮肿毒等，由金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等中药组成，均具有清热解毒的功效［2⁃7］。目前，关于五味消毒饮中单味药的化学成分报道较多，但对于整方以及物质基准的化学成分报道较少，其发挥药效作用的物质基础尚不明确，制约了该经典名方的进一步开发。

高分辨率质谱（HRMS）可为化合物的结构鉴定提供丰富的信息，极大地提升了化学成分鉴定效率，成为中药化学成分鉴定的常用方法［8⁃12］。其中，UHPLC⁃Q⁃Exactive Orbitrap 可进行高分辨率和高质量精度质谱数据采集，保证筛查结果的可靠和准确性。本研究采用UHPLC⁃Q⁃Exactive Orbitrap MS 技术，对五味消毒饮煎液的化学物质进行系统分析，进一步为该方的药效物质基础、药效物质传递、质量控制等奠定基础。

1 材料

UHPLC⁃Q⁃Exactive Orbitrap 高分辨质谱（配有电喷雾离子源）、XCalibur 2.1 质谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；超声波清洗机（上海比朗仪器制造有限公司）；Waters HSS T3 UPLC色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

蒙花苷（批号111737⁃201910）、秦皮乙素（批号110741⁃201908）、绿原酸（批号110753⁃201916）、阿魏酸（批号110773⁃201914）、芹菜素（批号110861⁃201912）、α⁃细辛醚（批号111638⁃201906）对照品购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A（批号Y24N8Y49009）、异绿原酸B（批号P25J6F1793）、异绿原酸C（批号P25J6F1794）对照品购自上海源叶生物有限公司；山柰酚（批号K110308）、甘草素（批号MUST⁃19101611）、咖啡酸（批号MUST⁃14100803）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司，以上对照品纯度均≥98%。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

金银花（批号190615，产地山东），购自山东平邑种植地；紫花地丁（批号190428，产地山西），购自河北安国药材市场；野菊花（批号190721，产地江苏）、蒲公英（批号200104，产地江苏）、天葵子（批号190529，产地安徽）购自安徽亳州药材市场，经济南市药检所宋希贵主任鉴定均为正品。

2 方法

2.1 五味消毒饮供试品溶液制备 称取金银花15 g、野菊花6 g、蒲公英6 g、紫花地丁6 g、紫背天葵子6 g，加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2次，每次30 min，滤液合并浓缩至500 mL，得五味消毒饮煎液。将该煎液进行冷冻干燥，得冻干粉。精密称取冻干粉0.5 g 于锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声处理30 min，摇匀滤过，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。同法制备各单味药材样品。

2.2 对照品溶液制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解，作为混合对照品溶液。

2.3 色谱及质谱条件 Waters HSS T3 UPLC 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相0.1%甲酸（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，5%B；1～35 min，5%～95% B；35～40 min，95%～5%B）；体积流量0.25 mL／min；柱温35 ℃；进样量3 μL。检测模式正负离子；氮气（纯度≥99.99%）分别作为鞘气和辅助气体；毛细管温度320 ℃；蒸发器温度320 ℃；喷涂电压3 500／3 200 V（＋／－）；分辨率70 000；高分辨扫描范围为m／z80～1 200；碰撞能30 eV；dd⁃MS2分辨率17 500。

2.4 数据处理 采用Thermo Xcalibur 2.1 工作站进行数据采集和处理。为了尽可能多地获得ESI⁃MS／MS 碎片离子，选择强度不低于40 000 的正离子模式和10 000 的负离子模式下的信号峰进行鉴定。根据精确分子质量、元素组成和可能发生的反应，对所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测设置。参数设置如下，C ［1⁃30］，H ［5⁃60］，O［1⁃20］，S ［0⁃2］，N ［0⁃5］ 和环不饱和双键数（RDB）［3⁃20］，质量精度误差在1×10－5以内。

3 结果

首先建立了基于高分辨液质联用鉴定中药化学成分的分析策略，进而开展五味消毒饮的化学成分定性研究。（1）根据中英文文献及网络数据库，检索五味消毒饮及各单味药材已报道的化学成分，建立该经典名方的化学成分数据库；（2）通过Orbitrap超高分辨率全扫描采集，在扫描质量误差小于5×10－6前提下，根据一级质谱提供的精确相对分子质量，运用Xcalibur 2.1 软件精确推测色谱峰的元素组成和分子式；（3）将未知化合物的二级碎片离子与现有文献和上述五味消毒饮成分库对比，初步推测该色谱峰归属；对于具有相同元素组成和相似质谱碎片的同分异构体，考察其色谱保留时间，推测色谱峰可能的结构；（4）归纳对照品和已确定的化学成分质谱裂解规律，结合天然产物质谱学一般裂解规律、不饱和度、N 规律、同位素峰度规律等，推测未知化合物的类型和结构。

基于以上研究策略，采用UHPLC⁃Q⁃Exactive Orbitrap MS 对供试品溶液和对照品溶液进行分析，得正负离子模式下的总离子流图。通过分析准分子离子峰、碎片离子信息，结合对照品和文献报道，共鉴别了61 个成分［13⁃40］，包括27 个黄酮类、23个酚酸类、2 个香豆素类、5 个含氮类及其他类化合物4 个。其中，12 个成分通过与对照品比对确认，见表1，其总离子流图见图1。

图1 五味消毒饮总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Wuwei Xiaodu Decoction

3.1 黄酮及其苷类成分 主要包括黄酮及其苷类、二氢黄酮及其苷类、多甲氧基黄酮类等。黄酮苷类结构上有糖基取代，黄酮苷元在A，B 环上常有羟基、甲基、甲氧基等取代基。因此，黄酮苷类化合物在裂解过程中，主要通过高能的碰撞失去糖基，形成丰度较高的黄酮苷元离子。而黄酮苷元则进一步裂解丢失侧链取代基和羰基，黄酮母核C 环则发生逆狄尔斯⁃阿尔德（RDA）裂解生成一系列特征离子峰［36］。以芹菜素为例，在负离子模式下产生准分子离子峰m／z269.05，推测其结构式为C15H9O5；其失去羰基形成m／z241.05 的特征碎片离子，继续丢失一分子氧形成碎片离子m／z225.06。对于黄酮类结构的识别最有意义的碎片离子离子是在1，3 位置由RDA 裂解生成的1，3A1（m／z151.00）和1，3B1（m／z117.03）离子，通过对比芹菜素对照品的保留时间和二级碎片离子确定为芹菜素，其裂解途径及二级质谱见图2。化合物47 在保留时间10.30 min 形成较强的色谱峰，在负离子模式下形成m／z445.08 的［M⁃H］－分子离子峰并进一步脱去1 分子葡萄糖醛酸残基（m／z176）形成m／z269.04 的苷元成分，并碎裂成m／z117.03、m／z151.00 等碎片，推测其为芹菜素的葡萄糖醛酸化产物。

图2 负离子模式下芹菜素质谱裂解途径（A）及其二级质谱图（B）Fig.2 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of apigenin in negative ion mode

二氢黄酮类化合物具有黄酮2、3 被氢化的基本母核，由于C 环为具有半椅式结构的非平面型结构，水溶性稍大，因此保留时间比一般的黄酮类化合物偏小。其质谱裂解规律与黄酮相似，但在RDA 裂解过程中更加倾向于产生1，3A1的碎片离子作为基峰［40］。化合物38 在负离子模式下，产生准分子离子峰m／z287.055 05，推测其分子式为C15H11O6。碎片离子m／z135.04 与m／z119.03 分别为特征碎片1，3A1和1，3B1，结合其保留时间，化合物38 被推断为圣草酚。化合物34 在负离子模式下产生准分子离子峰m／z449.108 15，推测其分子式为C21H21O11，其中性丢失葡萄糖残基（m／z162）产生苷元m／z287.05，苷元产生与圣草酚相同的碎片离子m／z135.04 与m／z119.03，结合保留时间推测化合物34 为圣草酚⁃7⁃O⁃葡萄糖苷。

3.2 酚酸类成分 大部分酚酸类成分在正离子模式下响应很低，从五味消毒饮中发现了酚酸类成分19个，主要包括奎宁酸酯类成分和其他酚酸类成分。

3.2.1 奎宁酸酯类成分 奎宁酸是日常饮食的常见成分，能够通过肠道菌群转化成色氨酸和烟酰胺，为人类必不可少的代谢成分提供了生理源［40］。化合物11 在负离子模式下产生准分子离子峰m／z191.054 76，推测其结构式为C7H11O6，结合碎片离子m／z93.03（C6H5O－）和中性丢失CO2所得碎片m／z147.07（C6H11O4－），推断其为奎宁酸。化合物1 在正离子模式下产生［M＋H］＋离子m／z123.054 84，其分子式为C6H7ON2，二级碎片离子m／z80.05 和m／z53.04 为［M＋H］＋离子依次丢失CNOH 和CNH 而得，结合文献［41］ 报道，推断化合物为烟酰胺。化合物8 在正离子模式下产生准分子离子峰m／z205.096 52，其分子式为C11H13O2N2。二级碎片离子m／z130.06 为准分子离子失去C2H5NO2所得，m／z118.07 为准分子离子失去C3H5NO2所得，结合文献［18，40］ 报道推断化合物8 为色氨酸。

奎宁酸常与咖啡酸形成咖啡酸酰奎宁酸酯类成分［17，42］，如绿原酸等广泛存在于中药材中。以绿原酸为例，在负离子模式下，产生准分子离子峰m／z353.087 25，推测其结构式为C16H17O9，在二级图谱中形成m／z191.05 的奎宁酸基峰碎片离子，并生成m／z161.02 和m／z135.04 的咖啡酸特征碎片离子，结合对照品保留时间与二级碎片图谱，鉴定化合物14 为绿原酸，其负离子模式质谱裂解规律和二级图谱见图3。

图3 负离子模式下绿原酸质谱裂解途径（A）及其二级质谱图（B）Fig.3 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of chlorogenic acid in negative ion mode

化合物7、12 和17 在负离子模式下都产生理论质荷比为m／z353.087 81 的准分子离子峰，且都产生了m／z191.05 的碎片离子，以及生成了m／z161.02 或m／z135.04 的碎片离子，与绿原酸裂解途径相一致，结合保留时间以及文献 ［17⁃18，42］ 报道，三者分别被鉴定为1、3、4⁃咖啡酰奎宁酸。

化合物41、42 和48 在负离子模式下产生［M⁃H］－离子m／z515.118 40（C25H23O12），同时产生了m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 等奎宁酸和咖啡酸特征碎片，故三者为奎宁酸酯类成分，结合对照品保留时间以及二级质谱图，三者分别被鉴定为异绿原酸A、B 和C。因此，碎片离子m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 可以作为诊断离子对奎宁酸酯类成分进行鉴别。

3.2.2 其他酚酸类成分 化合物6 在负离子模式下，检测到m／z153.017 96 的准分子离子峰，分子式为C7H5O4，在二级质谱裂解中通过丢失一个·COOH自由基产生m／z108.02 的碎片离子峰，化合物6 鉴定为原儿茶酸。化合物15 在负离子模式下产生m／z179.033 55 的分子离子峰，其分子式为C9H7O4，在其二级质谱中，产生中性丢失CO2后的碎片离子m／z135.04 以及丢失C3H4O2后的碎片离子m／z108.02，结合对照品保留时间以及二级质谱图，其被鉴定为咖啡酸。化合物28 在负离子模式下产生m／z193.049 47 的准分子离子峰，其结构式为C10H9O4，二级质谱由于丢失·CH3、CO2和·CH3＋CO2而产生m／z178.03、m／z148.95 和m／z133.03 的碎片离子，结合对照品保留时间以及二级图谱，其被确定为阿魏酸。

3.3 香豆素类成分 从五味消毒饮中发现简单香豆素类成分2个，为苷元秦皮乙素和其葡萄糖苷秦皮甲素。根据秦皮乙素的对照品保留时间和质谱信息，化合物13 被鉴定为秦皮乙素。化合物9 在负离子模式下产生准分子离子峰m／z339.071 41，其分子式为C15H15O9，在其二级质谱中，中性丢失葡萄糖残基（m／z162）产生了苷元基 峰m／z177.02，继而连续丢失CO 产生碎片m／z149.02 和m／z121.03，鉴定为秦皮甲素。其质谱裂解规律和二级质谱图见图4。

图4 负离子模式下秦皮甲素质谱裂解途径（A）及其二级质谱图（B）Fig.4 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of esculin in negative ion mode

3.4 含氮类化合物 共鉴别5 个含氮类，包括3个核苷，1 个氨基酸和1 个酰胺类化合物。其中化合物1 和8 被鉴定为烟酰胺和色氨酸，化合物2、3、5 为核苷类物质。核苷类物质在质谱中通常会失去核糖残基（m／z132）而生成嘧啶或嘌呤基峰。化合物2 在负离子模式下生成准分子离子峰m／z243.061 39，计算其分子式为C9H11O6N2。在二级质谱中，碎片离子m／z110.02 比准分子离子峰小132，证明了核糖的存在，其继续失去一分子CO 形成m／z83.02 的碎片离子，最终化合物2 被鉴定为尿苷。含有氨基的核苷类物质在质谱中常常会失去NH3，化合物5 其负离子模式下准分子离子峰m／z282.083 68 的分子式为C10H12O5N5，在二级质谱中，m／z133.01 为准分子离子峰连续中性丢失核糖残基（m／z132）和NH3（m／z17）而形成的，结合保留时间鉴定化合物5 为鸟苷。

3.5 其他化合物 鉴别出了寡糖、脂肪酸、苯丙素类成分。化合物4 在负离子模式下准分子离子峰为m／z341.108 34，分子式为C12H21O11，在其二级质谱中产生m／z161.02 和m／z113.02 等碎片离子，结合保留时间，化合物4 被鉴定为蔗糖。化合物60 和61 分别被鉴定为棕榈酸和油酸，来源于野菊花、蒲公英和天葵子药材，二者均产生中性丢失CO2后的碎片离子m／z237.22 和m／z211.20。化合物59 在负离子模式下产生 ［M⁃H］－离子m／z207.101 41，分子式为C12H15O3，在负离子模式下丢失一分子烯丙基得到m／z167.05 碎片离子，同时伴随脱·CH3后的碎片离子m／z193.09，结合对照品保留时间和二级质谱图，化合物59 被鉴定为α⁃细辛醚。

4 讨论

经典名方物质基准的研究是顺利开发经典名方制剂的关键环节［43］，中药复方中含有较为复杂的化学成分，明确化学成分的组成对于阐明其药效物质基础、制定质量标准和进一步研究制备工艺具有重要意义。近年来我国对于五味消毒饮的成分研究多集中在指纹图谱的建立以及单成分的定量中，五味消毒饮的指纹图谱对10 种成分进行了含量测定［44］；建立五味消毒饮口服液的HPLC 法特征指纹图谱，并同时测定6 种主要指标成分的量［45］；采用HPLC 法同时测定五味消毒饮中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素4 种活性成分［46］。

本研究采用UHPLC⁃Q⁃Exactive⁃Orbitrap 高分辨质谱对五味消毒饮的物质组成进行研究，比较全方基准物质与单味药材的质谱数据，通过获得的准分子离子峰、二级碎片离子峰结合参考文献和数据库以及对照品信息共鉴定出61 个化合物，以黄酮类、酚酸类、香豆素类以及含氮类成分为主，其中黄酮和酚酸类成分存在于金银花、野菊花、紫花地丁，香豆素类成分多来源于紫花地丁，含氮类多来源于天葵子中，说明五味消毒饮物质基准未失去各味药的主要成分，未产生新的成分。对于五味消毒饮的化学组成进行了较为系统的阐释，并对药材来源进行了归属，可为深入分析其药效物质基础及质量标准的建立提供依据，为五味消毒饮制剂开发提供有力的数据支撑，也为其他经典名方的研究提供了参考。