金合欢素纳米混悬剂的制备及其体内药动学研究

张佩琛王涛

（1.郑州澍青医学高等专科学校， 河南 郑州450064； 2.郑州大学， 河南 郑州450001）

金合欢素是一种黄酮类化合物，广泛存在于洋槐树、金合欢树、密蒙花、菊花、大蓟等植物的根茎中，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、心脏保护、抗骨质疏松、抗动脉粥样硬化、抗炎、免疫调节等作用［1⁃4］，但该成分溶解度仅为36.43 μg／mL［5］，会影响其溶出速率及溶出度，而且口服生物利用度仅为2.34%［6］，又会限制药效发挥。胡瑞瑞等［7］制备了金合欢素聚乳酸纳米粒，但其载药量仅为6.08%。

纳米混悬剂无需载体材料即有较高的载药量，并且药物溶解度、溶出度、生物利用度、药效等参数均可明显改善［8⁃10］，在医药领域应用潜力较大，工业化程度较高。因此，本实验将金合欢素制成纳米混悬剂，采用Box⁃Behnken 响应面法优化该工艺，并考察其体内药动学，以期为该制剂后续开发利用提供参考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ATS 型均质机（德国 Seeker公司）；MSE125P⁃CE 型电子天平（配置防风罩，德国Sartorius 公司）；HJ⁃2 磁力加热搅拌器（青岛创聚环保集团有限公司）；Nano⁃S90 型粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；FD⁃1C⁃50 型实验室冷冻干燥机（上海贺帆仪器有限公司）；QIMO⁃DCY⁃12 S 型氮气吹扫仪（上海琪摩电子科技有限公司）。

金合欢素对照品（批号110981⁃201910，纯度99.0%，中国食品药品检定研究院）；金合欢素原料药（批号20191026，纯度97%，成都嘉叶生物科技有限公司）。十二烷基磺酸钠（SDS，批号171114，国药集团化学试剂有限公司）；氯磺丙脲（批号200218，美国Sigma 公司）；PVP K30（批号190506）、泊洛沙姆188（批号181225）（安徽山河药用辅料有限公司）。

SD 大鼠，体质量（240±20）g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（豫）2016⁃0001，饲养于温度、相对湿度分别为（25±2）℃、（45±5）%的环境下。

2 方法与结果

2.1 纳米混悬剂制备 取50 mg 金合欢素原料药，加入30 mL 有机溶剂（四氢呋喃∶乙醇＝1∶1），65 ℃、1 000 r／min 磁力搅拌至溶解，作为有机相；称取一定量PVP K30、SDS，加入100 mL 蒸馏水，65 ℃、1 000 r／min 磁力搅拌至溶解，作为水相，将有机相缓慢滴加到水相中，在45 ℃下旋转蒸发30 min 除去有机溶剂，在均质压力1 000 bar（1 bar＝100 kPa）下循环均质数次，加入蒸馏水至100 mL，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 粒径测定 取0.1 mL 纳米混悬剂，加入4 mL蒸馏水混匀，取适量至比色皿中，置于粒度分析仪中测定粒径。

2.3 Box⁃Behnken 响应面法 固定金合欢素用量为50 mg，稳定剂为PVP K30、SDS 混合物，选择PVP K30 占比（X1）、稳定剂用量（X2）、均质次数（X3）作为影响因素，粒径（Y）作为评价指标，Box⁃Behnken 响应面法优化制备工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

对表2 数据进行拟合，得二次多元回归方程为Y＝214.62＋10.100X1－25.94X2－35.84X3＋19.38X1X2－46.93X1X3－5.55X2X3＋19.61＋71.39＋77.89，R2＝0.997 5，AdjR2＝0.994 2，表明模型拟合度良好，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性；失拟项P＞0.05，表明未知因素干扰很小，模型可信度较高，可用于优化；因素X2、X3、X1X2、X1X3、有极显著影响（P＜0.01）。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design Expert V8.0.6 软件进行响应面分析，结果见图1。由此可知，均质次数不变时，随着PVP K30 占比或稳定剂用量增加，粒径先减小后增大，可能是由于两者不足时会影响稳定效果，导致纳米粒之间发生融合、聚集等现象，使得粒径较大，但两者过量时稳定剂会吸附在纳米颗粒表面，粒径也会变大［10］；稳定剂用量不变时，随着均质次数增加，粒径先减小后增大，可能是由于均质次数过少时不足以形成较小粒径的纳米混悬剂，但过多时会破坏纳米粒稳定剂保护层［8］，进而发生融合、聚集等，导致粒径变大；PVP K30 占比不变时，随着均质次数增加，粒径先减小后增大，可能是由于均质次数过多时纳米混悬剂温度较高［8］，影响了体系稳定性，导致粒径变大。最终确定，最优工艺为PVP K30 占比47.16%，稳定剂用量215.04 mg，均质次数11.92次，粒径为209.8 nm，为便于操作，将其修正为PVP K30 占比47%，稳定剂用量215 mg，均质次数12 次。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

2.4 HPLC 法测定金合欢素含量

2.4.1 色谱条件 Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃0.2% 磷酸（45∶55）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长268 nm；进样量20 μL。

2.4.2 线性关系考察 称取金合欢素对照品10 mg至100 mL 量瓶中，甲醇超声溶解并定容，得100 μg／mL 贮备液，流动相依次稀释成20、10、1、0.5、0.1、0.05 μg／mL 对照品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝13.645 9X＋1.426 7（r＝0.999 9），在0.05～20 μg／mL范围内线性关系良好。

2.4.3 供试品溶液制备 取1 mL 纳米混悬剂，置于50 mL 量瓶中，加入30 mL 甲醇超声处理5 min，甲醇定容至刻度，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4.4 方法学考察 取同一份纳米混悬剂，按“2.4.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得金合欢素峰面积RSD 为0.67%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得金合欢素峰面积RSD 为0.58%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。取20、1、0.05 μg／mL 对照品溶液适量，在“2.4.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得金合欢素峰面积RSD 分别为0.36%、0.29%、0.44%，表明仪器精密度良好。取9 份供试品溶液，每份0.5 mL，平均分为3组，每组3份，分别加入“2.4.2”项下贮备液1.5、2.5、3.5 mL，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得金合欢素平均加样回收率分别为101.16%、99.27%、100.54%，RSD 分别为1.68%、0.61%、0.83%。

2.5 验证试验及载药量测定 按“2.3”项下优化工艺平行制备3 批纳米混悬剂，分别取0.1 mL，加入4 mL 蒸馏水混匀，测定粒径、Zeta 电位。结果，平均粒径为214.7 nm（图2），PDI 为0.094，Zeta 电位为－31.6 mV（图3）。

图2 金合欢素纳米混悬剂粒径分布Fig.2 Particle size distribution of acacetin nanosuspensions

图3 金合欢素纳米混悬剂Zeta 电位Fig.3 Zeta potential of acacetin nanosuspensions

取1 mL 纳米混悬剂至50 mL 量瓶中，加入30 mL甲醇超声处理5 min，甲醇定容至刻度，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算金合欢素含量（M2），平行3 次；另取1 mL，在－40 ℃下预冻48 h 后真空低温冻干得粉末，称定质量（M1），平行3次，计算载药量，公式为载药量＝（M2／M1）×100%。结果，平均载药量为18.77%。

2.6 冻干粉制备及表征

2.6.1 制备工艺 取纳米混悬剂适量，加入6%甘露醇振荡溶解，取3 mL 至西林瓶中，在－40 ℃下预冻48 h，迅速置于－20 ℃冷冻干燥机中抽真空，冻干48 h 后取出，即得，立即密封并置于干燥器中保存，外观见图4。取3 批冻干粉，蒸馏水复溶，测得其平均粒径为248.14 nm。

图4 冻干粉外观Fig.4 Appearance of lyophilized powder

2.6.2 溶解度测定 取过量原料药、物理混合物（PVP K30＋SDS，比例同最优工艺）、纳米混悬剂冻干粉适量置于烧杯中，加蒸馏水，室温1 000 r／min磁力搅拌3 d，取上层混悬液，8 500 r／min 离心20 min，取上清液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算溶解度，结果见图5。由此可知，物理混合物将原料药溶解度提高至1.22倍，而纳米混悬剂可提高至11.71 倍。

图5 各样品溶解度（n＝3）Fig.5 Solubilities of various samples（n＝3）

2.6.3 沉降体积比考察 取原料药、物理混合物、纳米混悬剂适量，置于50 mL 具塞量筒中，振荡1 min，记录初始高速（H0），再于室温环境（温度25 ℃、相对湿度55%）下静置3 h，记录最终高度（H），计算沉降体积比，公式为沉降体积比＝H／H0。结果，纳米混悬剂未发生沉淀，沉降体积比为1，而原料药、物理混合物均下降至0.62。

2.7 体外溶出研究 取原料药、物理混合物、纳米混悬剂冻干粉适量（以金合欢素计均为10 mg），加入4 mL 蒸馏水制成混悬液，置于活化后的透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），细尼龙绳将两端扎紧，选择900 mL 0.5%SDS 溶液作为溶出介质，在温度37 ℃、转速100 r／min 条件下于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、12 h各取样3 mL，同时补加3 mL 空白溶出介质，过0.45 μm 水相微孔滤膜，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算溶出度，结果见图6。由此可知，原料药12 h 内累积溶出度不足40%；物理混合物12 h 内累积溶出度也仅提高至47.07%；纳米混悬剂6 h 内累积释放度接近90%，12 h 内达95.82%。

图6 金合欢素体外溶出曲线（n＝3）Fig.6 In vitro dissolution curves for acacetin（n＝3）

2.8 体内药动学研究

2.8.1 HPLC⁃MS 分析条件 ZORBAX SB C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈⁃0.1%甲酸（20∶80）；体积流量0.2 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL；电喷雾离子源，负离子扫描；毛细管电压3 000 V；雾化气压力30 psig（1 psig ＝68.194 8 kPa）；干燥气体积流量8 L／min，温度325 ℃；定量分析离子m／z285.22（金合欢素）、m／z277.60（氯磺丙脲，内标）。

2.8.2 分组、给药及血浆处理 取原料药、物理混合物、纳米混悬剂冻干粉末适量，制成0.5%CMC⁃Na 混悬液，作为灌胃液（以金合欢素计，质量浓度为7 mg／mL）。取18 只禁食12 h 的大鼠，随机分为3组，每组6只，按50 mg／kg 剂量灌胃给药。乙醚麻醉大鼠后，原料药组于0、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4 h 采血，物理混合物组增加5 h 取血点，纳米混悬剂组增加5、6、8 h取血点，分别取约0.2 mL，置于肝素化离心管中，3 000 r／min 离心3 min，得含药血浆，吸取50 μL，加入10 μL 内标溶液（将含100 μg／mL 乙腈的氯磺丙脲对照品母液用乙腈稀释至400 ng／mL，即得）、1.5 mL 乙腈，密封涡旋6 min，8 000 r／min离心5 min，取上层有机相，45 ℃氮气缓慢吹干，加入50 μL 甲醇超声处理3 min，进样分析。

2.8.3 线性关系考察 取500 ng／mL 对照品溶液，乙腈逐步稀释至250、200、100、50、10 ng／mL，分别取50 μL，45 ℃氮气缓慢吹干，加入50 μL 空白血浆，密封涡旋6 min，即得血浆对照品溶液，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.8.1”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），金合欢素、内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.057 1X＋0.305 4（r＝0.994 2），在10～500 ng／mL 范围内线性关系良好。

2.8.4 专属性考察 取空白血浆、内标＋灌胃给药4 h 后血浆、内标＋血浆对照品溶液（10 ng／mL）适量，在“2.8.1”项条件下进样测定，结果见图7。由此可知，金合欢素色谱峰与其他杂质峰分离度理想，表明该方法专属性良好。

图7 金合欢素提取离子流色谱图Fig.7 Extraction ion current chromatograms of acacetin

2.8.5 方法学考察 取10、200、500 ng／mL 质控样品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.8.1”项条件下进样测定，计算峰面积（ρ1）；取50 μL 空白血浆，按“2.8.2”项下方法处理（不加内标）得残渣，加入10、200、500 ng／mL对照品溶液及内标溶液，在“2.8.1”项条件下进样 测定，计算峰面积（ρ2）；取 10、200、500 ng／mL质控样品溶液（不按“2.8.2”项下方法处理），在“2.8.1”项条件下进样测定，计算峰面积（ρ3），根据公式（ρ2／ρ3）×100% 计算基质效应，（ρ1／ρ2）×100%计算提取回收率，结果低、中、高质量浓度金合欢素基质效应分别为96.15%、93.27%、94.55%，提取回收率分别为90.69%、94.74%、89.07%，而内标两者分别为95.17%、93.21%，表明该方法基质效应较小。取灌胃给药1 h后血浆，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.8.1”项条件下进样测定，测得金合欢素、内标峰面积比值RSD 为11.01%，表明血浆在24 h 内稳定性良好。取10、200、500 ng／mL 血浆对照品溶液，同一天内在“2.8.1”项条件下各进样测定6次，测得金合欢素、内标峰面积比值RSD分别为9.61%、6.28%、8.17%，表明日内精密度良好，再根据随行标准曲线计算金合欢素含量，测得其准确度分别为107.52%、95.38%、103.91%；同法每天各测定6次，连续6 d，测得两者比值RSD 分别为11.73%、8.64%、9.84%，表明日间精密度良好，准确度分别为103.66%、108.92%、97.16%。

2.8.6 结果分析 采用实测值计算tmax、Cmax，梯形法计算AUC，结果见表4，血药浓度⁃时间曲线见图8。由此可知，与原料药比较，物理混合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05），表明辅料增溶作用促进了药物吸收，但作用有限，相对生物利用度仅提高至1.33 倍；纳米混悬剂tmax缩短（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升 高（P＜0.01），相对生物利用度提高至5.18倍，程度远大于物理混合物。

表4 金合欢素主要药动学参数（，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for acacetin（，n＝6）

表4 金合欢素主要药动学参数（，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for acacetin（，n＝6）

注：与金合欢素比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

图8 金合欢素血药浓度⁃时间曲线（n＝6）Fig.8 Plasma concentration⁃time curves for acacetin（n＝6）

3 讨论

PVP K30 与SDS 联合应用作为稳定剂时，纳米混悬剂粒径较小，可能是由于前者黏度较大，可有效抑制纳米粒子的碰撞，并且分子链较长，提供了较大的空间位阻效应［11⁃13］；后者是一种阴离子表面活性剂，可有效降低界面张力，有利于在制备过程中降低粒径［11］，但稳定剂总用量、PVP K30 占比对粒径影响较大，故结合预实验对两者（100～300 mg、30%～70%）进行优化。另外，均质压力过小或过大均会导致粒径变大，故本实验在均质压力100 000 kPa 的前提下对均质次数（5～15 次）进行优化。

据文献［2⁃3］ 报道，大鼠口服金合欢素剂量为10～80 mg／kg时即有明显的神经保护、降血脂、抗动脉粥样硬化等作用，故本实验选择50 mg／kg进行药动学研究。结果，金合欢素纳米混悬剂大大降低了药物粒径，药物溶出速率明显提高［13⁃14］，导致tmax显著缩短，Cmax升高，可能与该剂型可有效改善药物溶解度、累积溶出度有关［15⁃16］。研究表明，纳米混悬剂可增加药物比表面积，有利于其充分吸收［17⁃20］；纳米药物具有较强的胃肠道渗透性［17］，可增加经胞间、淋巴循环等途径进入血液循环［21］。本实验发现，将金合欢素制成纳米混悬剂后生物利用度提高至5.18 倍。今后，将对金合欢素纳米混悬剂的注射药动学、毒性、药效学等指标作进一步研究。