lncRNA H19靶向miR-30a-5p对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞凋亡、炎症因子分泌和自噬的影响

王春晖,潘 卓,唐忠明

王春晖,潘卓,湖州市第一人民医院外科 浙江省湖州市 313000

唐忠明,湖州市第一人民医院消化科 浙江省湖州市 313000

0 引言

急性胰腺炎是胰腺的一种炎症性疾病,轻症以胰腺水肿和出血为主,重症可出现组织坏死,预后较差[1,2].长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子,广泛参与细胞分化、增殖、凋亡和炎症等调控过程[3,4].如lncR-RGD1566401的上调表达能够促进大鼠急性胰腺炎AR42J细胞凋亡[5].LncRNA浆细胞瘤多样异位基因1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)可通过调控微小RNA(miR)-30a-5p表达,促进胰腺腺泡细胞自噬,加重急性胰腺炎[6].LncRNA核内富集转录物1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)下调可通过海绵miR-365a-3p缓解雨蛙肽诱导的腺泡细胞炎症损伤[7].

已有研究报道lncRNA H19在急性胰腺炎中异常表达,与疾病严重程度有关[8].但lncRNA H19在胰腺腺泡细胞损伤中的作用及机制还有待进一步探究.本研究利用雨蛙肽诱导胰腺AR42J细胞构建体外急性胰腺炎细胞模型,以期揭示lncRNA H19在细胞损伤中的调控作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺AR42J细胞购自中科院上海细胞库;改良Eagle培养基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培养基购自美国Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Promega公司;雨蛙肽购自美国BD公司;脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;TRIzol试剂购自大连宝生物科技有限公司;膜联蛋白V异硫氰酸荧光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡试剂盒购自美国Cell Signaling公司;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒购自北京天根生化科技公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理: 胰腺AR42J细胞用含10% FBS的DMEM培养基培养,置于37 ℃、5% CO2条件中,待细胞融合至60%-90%时,更换含有浓度100 nM雨蛙肽的培养基继续培养24 h,建立胰腺损伤细胞模型.

细胞转染和分组: 使用Lipofectamine 2000转染试剂,根据试剂说明书,分别将终浓度为30 nM-50 nM的si-NC、si-H19、miR-NC、miR-30a-5p、si-H19与anti-miRNC、si-H19与anti-miR-30a-5p转染AR42J细胞.转染48 h后,更换常规培养基培养24 h,然后再更换含100 nM雨蛙肽的培养基培养24 h,根据转染基因不同,分别将细胞记为雨蛙肽+si-NC组、雨蛙肽+si-H19组、雨蛙肽+miRNC组、雨蛙肽+miR-30a-5p组、雨蛙肽+si-H19+antimiR-NC组、雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p组.

1.2.2 RT-qPCR检测H19和miR-30a-5p表达水平: 采用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA,反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA.使用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行RT-PCR反应.循环条件为95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环,60 ℃延长5 min.2-ΔΔCt方法计算H19和miR-30a-5p相对表达水平.

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡: 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次,与500 μL的结合缓冲液混匀.先加入10 μL的Annexin V-FITC,再加入5 μL的PI,混匀后避光孵育10 min.用流式细胞仪检测细胞凋亡率.

1.2.4 ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平: 采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平,按照试剂盒附带的说明书进行实验步骤.

1.2.5 双荧光素酶报告实验检测H19和miR-30a-5p的靶向关系: 将含有miR-30a-5p结合位点的H19野生型(wildtype,WT)序列或突变型(mutant-type,MUT)序列克隆到荧光素酶报告质粒,构建成荧光素酶报告基因载体WTH19和MUT-H19.将miR-30a-5p、miR-NC分别与WT-H19或者MUT-H19共转染至雨蛙肽诱导AR42J细胞,测定各组细胞的荧光素酶活性.并将si-NC、si-H19、pcDNANC、pcDNA-H19分别转染至雨蛙肽诱导AR42J细胞中,参照RT-qPCR步骤检测细胞miR-30a-5p表达水平.

统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料用平均数±标准差(mean±SD)表示,两组比较行t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.统计学显著性用aP＜0.05表示,同一表中另一套P值,则用cP＜0.05.

2 结果

2.1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽诱导的AR42J细胞中的表达 与正常胰腺细胞比较,雨蛙肽诱导损伤的胰腺炎细胞中H19表达水平显著升高,miR-30a-5p表达水平显著降低(P＜0.05).见表1.

表1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽诱导的AR42J细胞中的表达(mean±SD,n=9)

2.2 低表达H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞凋亡、炎症因子和自噬的影响 与雨蛙肽+si-NC组比较,雨蛙肽+si-H19组H19表达水平显著降低;细胞存活率显著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低;微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)-I蛋白表达显著降低、LC3-II蛋白表达显著升高(P＜0.05).见表2和图1.

图1 敲低H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞炎症和自噬的影响.A: 酶联免疫吸附实验检测炎症因子的分泌;B: 蛋白质印迹检测蛋白的表达.雨蛙肽+si-NC组 vs 雨蛙肽+si-H19组,aP＜0.05.TNF-α: 肿瘤坏死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ.

表2 敲低H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞存活的影响(mean±SD,n=9)

2.3 高表达miR-30a-5p对雨蛙肽诱导的AR42J细胞存活、炎症因子和自噬的影响 与雨蛙肽+miR-NC组比较,雨蛙肽+miR-30a-5p组miR-30a-5p表达水平显著升高;细胞存活率显著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低;LC3-I蛋白表达显著降低、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高(P＜0.05).见表3和图2.

图2 高表达miR-30a-5p对雨蛙肽诱导的AR42J细胞炎症和自噬的影响.A: 酶联免疫吸附实验检测炎症因子的分泌;B: 蛋白质印迹检测蛋白的表达.雨蛙肽+miR-NC组 vs 雨蛙肽+miR-30a-5p组,aP＜0.05.TNF-α: 肿瘤坏死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ:微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ.

表3 高表达miR-30a-5p对雨蛙肽诱导的AR42J细胞存活影响(mean±SD,n=9)

2.4 H19靶向miR-30a-5p表达 LncBase Predicted v.2预测H19和miR-30a-5p之间存在结合位点,见图3.双荧光素酶报告显示,与转染miR-NC比较,转染miR-30a-5p可降低WT-H19的相对荧光素酶活性(P＜0.05),而对MUT-H19的相对荧光素酶活性无显著影响(P＞0.05),见表4.

图3 H19和miR-30a-5p靶向结合图.LncBase Predicted v.2预测H19和miR-30a-5p之间存在结合位点.WT-H19: H19野生型;MUT-H19:H19突变型.

表4 双荧光素酶活性检测(mean±SD,n=9)

RT-qPCR检测显示,与雨蛙肽+si-NC组比较,雨蛙肽+si-H19组细胞miR-30a-5p表达水平显著升高(P＜0.05);与雨蛙肽+pcDNA-NC组比较,雨蛙肽+pcDNA-H19组细胞miR-30a-5p表达水平显著降低(P＜0.05),见表5.

表5 qRT-PCR检测miR-30a-5p表达(mean±SD,n=9)

2.5 低表达miR-30a-5p可以逆转低表达H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞凋亡、炎症因子和自噬的影响 与雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比较,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p组miR-30a-5p表达显著降低;细胞存活率显著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高;LC3-Ⅰ蛋白表达显著升高、LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P＜0.05).见表6和图4.

图4 低表达miR-30a-5p可以逆转低表达H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞炎症和自噬的影响.A: 酶联免疫吸附实验检测炎症因子的分泌;B:蛋白质印迹检测蛋白的表达.雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC组 vs 雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p组,aP＜0.05.TNF-α: 肿瘤坏死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ.

表6 低表达miR-30a-5p可以逆转低表达H19对雨蛙肽诱导的AR42J细胞存活的影响(mean±SD,n=9)

3 讨论

急性胰腺炎是一种比较常见的消化系统疾病,成年人发病概率比较高,根据病理分型可分为间质水肿型和坏死型两种.引起该病的病因非常多,在我国最常见的是胆石症、酒精和高脂血症[9,10].

LncRNA H19在急性胰腺炎患者的血清中表达升高,且对于急性胰腺炎诊断和严重程度的预判具有一定临床价值[11].重症急性胰腺炎大鼠胰腺中miR-30a-5p表达显著降低[12].本实验研究发现,与正常胰腺细胞比较,雨蛙肽诱导急性胰腺炎细胞中H19表达水平显著升高,miR-30a-5p表达水平显著降低.此外,有研究表明沉默lncRNA H19可减少雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞凋亡,其可能成为治疗急性胰腺炎的潜在有效靶点[13].本实验研究表明,与雨蛙肽+si-NC组比较,雨蛙肽+si-H19组H19表达水平显著降低;细胞存活率显著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低;LC3-I蛋白表达显著降低、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高.

miRNA是一类长度约19-22个核苷酸的非编码RNA,是重要的转录后调控因子[14,15].已经有研究报道,miR-155抑制剂能够降低重症急性胰腺炎大鼠炎症因子,减轻重症急性胰腺炎急性肺损伤[16].急性胰腺炎患者外周血miR-16和miR-192表达及其与病情严重程度密切相关[17].miR-7a-5p可促进急性胰腺炎腺泡细胞凋亡并降低细胞增殖能力[18].本实验研究结果,与雨蛙肽+miRNC组比较,雨蛙肽+miR-30a-5p组miR-30a-5p表达水平显著升高;细胞存活率显著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低;LC3-I蛋白表达显著降低、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高.

本实验研究显示,与雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比较,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p组miR-30a-5p表达显著降低;细胞存活率显著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高;LC3-Ⅰ蛋白表达显著升高、LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低.有类似的研究报道与本实验一致.LncRNA β-1,3半乳糖基转移酶-反义5(β-1,3-galactosyltransferase 5-AS1,B3GALT5-AS1)靶向miR-361-3p调节大鼠胰腺腺泡细胞增殖及凋亡[19].miR-141-3p靶向调控CUE结构域蛋白2(CUE domain-containing protein 2,CUEDC2)基因影响雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤[20].miR-7靶向特异性蛋白3(specific protein 3,Sp3)影响急性胰腺炎腺泡细胞增殖和凋亡[21].

4 结论

综上所述,下调H19靶向上调miR-30a-5p抑制雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞凋亡、炎症因子分泌和自噬.

文章亮点

实验背景

急性胰腺炎是一种死亡率较高的严重疾病,严重威胁着人类健康.探究影响急性胰腺炎进程的分子机制,有望为其治疗提供理论依据.

实验动机

许多长链非编码RNA被证实参与了急性胰腺炎进程,但是H19在急性胰腺炎进程中的作用和潜在分子机制值得进一步揭示.对H19作用的探究可能为其成为急性胰腺炎的治疗靶点提供证据.

实验目标

本研究希望通过揭示调控急性胰腺炎进程的潜在分子机制,为急性胰腺炎的治疗提供有效分子靶点.

实验方法

雨蛙肽诱导建立胰腺损伤细胞模型.通过细胞计数实验和流式细胞术检测细胞活力和凋亡;酶联免疫吸附实验评估炎症因子的分泌;蛋白质印迹法检测细胞自噬相关蛋白表达.双荧光素酶实验检测细胞中H19和miR-30a-5p靶向结合关系.

实验结果

H19敲低可以改善雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞凋亡、炎症和自噬.H19可以靶向miR-30a-5p,且其敲低对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞损伤的影响可以被miR-30a-5p抑制剂所逆转.

实验结论

H19通过靶向miR-30a-5p促进雨蛙肽诱导的急性胰腺炎细胞损伤,表明其可能对急性胰腺炎进程有促进作用.

展望前景

H19可能是急性胰腺炎治疗的潜在分子靶点.未来可以在临床水平以及动物水平进一步证实H19/miR-30a-5p调控急性胰腺炎进程的结论.