基于近红外建立冻藏鮰鱼片动力学货架期模型

周俊鹏，阙 凤，石钢鹏，石 柳，汪 兰，吴文锦，李 新，丁安子，王 军，熊光权

(1 湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068;2 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064)

斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)，属鲶形目，鮰科，是一种原产于美洲的淡水鱼，目前已在我国20多个省市养殖，成为我国重要的淡水经济鱼种之一[1]。因其高蛋白、高水分含量、多种氨基酸等特点[2]，斑点叉尾鮰鱼肉在贮藏过程中易腐败变质[3]，不仅会造成商品价值降低，而且易引发食品安全问题。因此，形成快速准确的鮰鱼肉制品货架期评价方法十分必要。目前，鱼肉新鲜度常采用化学评价方法进行评价，如挥发性盐基氮(TVB-N)、K值、硫代巴比妥酸(TBA)、三甲胺(TMA)和生物胺等化学指标[4]。李辉[5]采用pH、TVBN和K值评价了牙鲆贮藏过程中新鲜度的变化；Ocao-Higuera等[6]以TVB-N、TMA等研究了冰藏条件下射线鱼的新鲜度；De Abreu等[7]通过TBA值研究大西洋比目鱼在冷冻条件下脂肪氧化与水解情况，将TBA值列为新鲜度评价有效指标之一。近年来，近红外光谱技术作为一种简便、快捷、绿色、高效的新型检测分析技术，在淡水鱼品质评价等方面受到广泛应用[7-10]，如Tito等[9]利用红外光谱对大西洋三文鱼的微生物数量进行预测；Ding等[10]使用近红外反射光谱技术结合支持向量回归方法建立鲢鱼K值的快速测定模型。在检测新鲜度指标的基础上，淡水鱼常采用化学反应动力方法进行货架期的预测。如Hong等[11]通过测定TVB-N、菌落总数和K值的变化实现鳙鱼货架期的预测；姜元欣等[12]采用TVB-N建立了冻藏罗非鱼的货架期预测模型，鞠健[13]通过测定脂肪的酸价、过氧化值和TBA建立冷藏鲈鱼的货架期预测模型。淡水鱼因种类、养殖环境、加工贮藏环境等差异，其货架期也存在差异。目前关于斑点叉尾鮰冻藏货架期的预测模型还没有相关研究与报道。

本研究以斑点叉尾鮰鱼肉为研究对象，分别在-6℃、-10℃、-14℃、18℃冷冻贮藏鮰鱼片119 d。在贮藏过程中使用近红外快速测定鮰鱼片的新鲜度指标(TVB-N、TBA、TMA和K值)，运用化学反应动力方法建立各指标的货架期预测模型。

1 材料

1.1 材料与试剂

鲜活的斑点叉尾鮰(约1～3 kg)购于湖北省武汉市白沙洲水产品批发市场。

高氯酸，上海灵峰化学试剂有限公司；苦味酸，山东西亚化学工业有限公司；腺嘌呤核糖三磷酸标品，上海源叶生物科技有限公司；硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠、盐酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、95%乙醇、石油醚(30～60℃)硫代巴比妥酸、冰醋酸、液体石蜡、甲苯、无水碳酸钾、甲醛、无水硫酸钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BCD-575WDBI 冰箱，青岛海尔股份有限公司；高效液相色谱仪，岛津(中国)有限公司；FoodScan 肉制品分析仪；FOSS HM 294 Homogeniser 230V，丹麦福斯。

2 方法

2.1 样品处理

在10℃冷库中将鮰鱼敲击致晕杀死，去除内脏、表皮，流水清洗干净后，取背部鱼肉，然后用PE包装袋分装(每袋约400 g)，分别于-6℃、-10℃、-14℃、-18℃贮藏119 d。其间，每间隔7 d分别进行近红外扫描和理化分析测定TVB-N、K值、TBA和TMA。

2.2 近红外新鲜度指标测定

采用透射式FoodScan近红外光谱扫描仪进行光谱采集。首先将仪器开机30 min进行自检及预热，将解冻后300 g样品置于FOSS HM 294高速均质器中绞碎(8000 r/min，5 min)，绞碎的样品置于样品盘(r×h=68×17 mm)，轻轻拍打除去样品中气泡并使样品表面平整。样品平衡至室温(约25℃)，使用FoodScanTM透射近红外光谱仪(2 nm分辨率，850～1050 nm)进行冻藏鮰鱼样品新鲜度扫描，分别获得鮰鱼冷冻贮藏中TVB-N、TBA、TMA和K值的近红外扫描值。

2.3 指标测定

2.3.1TVB-N含量参考GB5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》方法并略作修改[13]。称取约5.0 g，置于锥形瓶中，加50 mL水，不时振摇，浸渍30 min后过滤，滤液置冰箱备用；将盛有10 mL吸收液及5～6滴混合指示液(V(甲基红)∶V(溴甲酚绿)=1∶5)的锥形瓶置于冷凝管下端，使之插入硼酸吸收液(20 g/L)液面下，准确吸取5.0 mL上述试样滤液于蒸馏器反应室内，加5 mL氧化镁混悬液(10 g/L)，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏5 min即停止，吸收液用盐酸标准滴定溶液(0.01 mol/L)标准滴定溶液滴定至紫红色，同时做试剂空白试验，计算试样中挥发性盐基氮的含量

式中：X为试样中的TVB-N值，mg·100 g-1,V1为测定用样液消耗盐酸溶液体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准溶液体积，mL；c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L；14为与1.00 mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，mg；m为试样质量，g。计算结果保留3位有效数字。

2.3.2TBA值参考Tarladgis等[14]方法，10 g绞碎的鱼肉于凯氏蒸馏瓶中，加入20 蒸馏水搅拌混合均匀，再加入2 mL盐酸溶液(m(HCl)∶m(H2O)= 1∶2)及2 mL液体石蜡，采用水蒸气蒸馏，收集50 mL蒸馏液。5 mL蒸馏液与5 mL TBA醋酸溶液(0.2883 g硫代巴比妥酸溶解于100 mL 90%冰醋酸)于25 mL比色管中充分混合，100℃水浴加热35 min后冷却10 min，在535 nm处测定吸光度A，以蒸馏水取代蒸馏液为空白样。

XTBA=A×7.8

式中：X为试样中的TBA值，mg/kg；A为样品溶液在535 nm吸光度值；7.8为换算系数。

2.3.3TMA的测定参考Yu等[14]方法略作修改，准确吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL 100 μg/mL三甲胺氮标准溶液于25 mL的比色管中，分别加蒸馏水至5 mL(相当于0、6、12、18、24、30 μg/mL三甲胺氮)，用蒸馏水做空白。向每支试管中依次加入10%甲醛溶液1 mL，无水甲苯10 mL及1+1碳酸钾溶液3 mL，立即盖塞，漩涡震荡2 min后静置20 min，待分层后吸去下面水层，加入0.5 g无水硫酸钠进行脱水，吸出5 mL萃取液于比色管中，再加入0.02%苦味酸5 mL显色，并轻轻振动使之混合，410 nm下读取吸光值，作含量-吸光度标准曲线；称取绞碎鱼肉约4.0 g加入20%三氯乙酸20 mL于具塞三角瓶，振摇后静置30 min，待蛋白质沉淀后过滤。取滤液5 mL于25 mL具塞比色管中，接下来的试验步骤同标准液的步骤一样，最后根据标准曲线计算样品中的三甲胺氮含量

式中：X为试样中的TMA值，mg·100 g-1,c为样品中三甲胺氮浓度，μg/mL；v为试样处理总体积，20 mL；m为试样质量，g。

2.3.4K值的测定参考Shi等[15]方法，取2.00 g绞碎的鱼肉，加10%(体积分数)高氯酸20 mL，漩涡震荡1 min，浆液离心(10000 r/min，4℃，6 min)分离，上清液沉淀用5%高氯酸20 mL洗涤，离心，最后合并上清液；用10 mol/L和1 mol/L NaOH溶液调节pH至6.4，并用蒸馏水定容至50 mL。用0.22 μmL滤膜过滤，滤液贮存于-20℃冰箱待测。HPLC条件：色谱柱Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm)，采用0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)平衡洗脱；样品进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温35℃，检测波长254 nm；ATP关联物标准品HPLC图谱的测定：ATP、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤核苷(HxR)、次黄嘌呤(Hx)以及它们的混合物在相同条件下测定，并绘制标准图谱。以测得的HxR、Hx之和与腺苷三磷酸关联化合物总量的百分比作为鲜度指标(K值)：

2.4 模型的建立及验证

2.4.1化学反应动力学货架期预测模型水产品在贮藏腐败过程中微生物的生长及相关化学反应产物的累计，一般遵循一级化学反应动力学[16-17]，将不同贮藏温度过程中新鲜度指标数值与贮藏时间进行非线性拟合，确定对应不同贮藏温度下各指标的反应速率常数K(表2)。

水产品在腐败过程中，其微生物生长繁殖及化学反应的进行，最主要的影响因素是温度。通常情况下采用Arrhenius公式表示反应速率常数K与温度的变化关系：

其中：K0为频率因子；Ea为活化能，J/mol；T为温度，K；R为常数8.314 J/(mo1/K)。K0和Ea是与相关物质性质有关的常数。将不同贮藏温度下各指标反应速率常数K，用lnK对热力学温度的倒数(1/T)进行线性拟合，依据斜率-Ea/R和截距lnK0求出不同指标的反应活化能Ea和反应速率常数K0，因此常采用不同贮藏温度的样品进行化学反应动力学货架期建立。

依据一级化学反应动力学和Arrhenius公式推导出货架期的预测方程：

因此，货架期预测模型

(1)

2.4.2化学反应动力学货架期预测模型的验证稳定性验证：将近红外扫描值与模型预测值进行对比，以相对误差值来评价化学反应动力学货架期预测模型的稳定性。准确度验证：将理化检测的实测值与模型预测值进行对比，以相对误差值来评价化学反应动力学货架期预测模型的准确度。

2.5 数据处理

采用SPSS 20.0和WPS2019进行相应数据处理、图表绘制及动力学货架期预测模型的建立。

3 结果与分析

3.1 冻藏鮰鱼片新鲜度变化

随着贮藏时间的延长，淡水鱼的新鲜度会逐渐降低直至腐败变质，因此常采用TVB-N、TBA、TMA和K值等化学指标对淡水鱼的新鲜度进行评价[18-19]。如图1-图4所示，随着贮藏时间的延长，近红外快速扫描与理化分析2种方式测定的冻藏鮰鱼片TVB-N、TBA、TMA和K值均呈逐渐增加趋势，且不同贮藏温度的鮰鱼片各新鲜度指标的增加速率具有一定的差异性。在冻藏过程中鮰鱼片TVB-N、TBA、TMA在贮藏前期呈缓慢增加的趋势，后期则呈现迅速上升，而K值则在贮藏过程中较其他新鲜度指标增长速率较快。在贮藏过程中，鮰鱼片在腐败微生物及相关蛋白酶的作用下，蛋白质被分解成氨及胺类等碱性含氮物质，且在贮藏过程中不断积累，因此TVB-N值逐渐增加[20]；脂肪易被氧化成醛、酮类化合物等脂肪氧化物，其与TBA试剂反应生成稳定的红色化合物可反映脂肪的氧化程度，因此随着脂肪氧化产物的累积，TBA值也呈现逐渐增加趋势[21]。随着贮藏时间延长，TMA含量贮藏增加，主要是因为鮰鱼片的氧化三甲胺在腐败微生物及酶的作用下分解成三甲胺、二甲胺和胺等物质[22]。鱼体在死亡后，鱼肉的三磷酸腺苷(ATP)逐步降解为二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤等物质，最终产物(HxR和Hx)在贮藏过程中逐渐积累，在这个过程中鱼肉的新鲜度也相应降低[6]。

图1 不同贮藏温度下鮰鱼片的TVB-N变化

图2 不同贮藏温度下鮰鱼片的TBA变化

图3 不同贮藏温度下鮰鱼片的TMA变化

图4 不同贮藏温度下鮰鱼片的K值变化

淡水鱼的TVB-N、TBA、TMA和K值等4个指标限定值分别是15 mg/100g[23]、0.5 mg MDA/kg[24]、0.15 mg/100g[25]和60%[26]。在不同贮藏温度下经不同新鲜度指标对鮰鱼片货架期进行评价，发现基于不同指标的货架期间存在着一定的差异性，且不同方式测定的同一指标的货架期也略有差异；随着贮藏温度降低，冻藏鮰鱼片的货架期呈逐渐延长，且不同指标在表征货架期方面也存在着一定的差异性，具体结果如表1所示。例如，这表明不同指标对鮰鱼片货架期的评定存在着一定的差异性，可能是因为在贮藏过程中不同指标的化学反应速率具有一定的差异性，这在林琳等[27]和鞠健[28]的研究中也得到了证实。不同的贮藏温度下鮰鱼片同种新鲜度指标的数值增加速率也存在一定差异性，其从大到小依次是-6℃>-10℃>-14℃>-18℃，这是因为低温能够有效抑制了腐败微生物的生长、相关蛋白酶的活性及相关化学反应的进行，使得不同贮藏温度下鮰鱼片同种新鲜度指标的产物累积存在着一定差异性[29]。

表1 不同贮藏温度下鮰鱼片近红外扫描值和实测值货架期

3.2 货架期预测模型的建立

利用SPSS 20.0对不同贮藏温度下近红外扫描新鲜度指标数值与贮藏时间的进行非线性拟合，其结果如表2所示。

表2 近红外扫描各指标非线性参数拟合

由表2可知，随着贮藏温度降低，各新鲜度指标的化学反应速率常数K逐渐减小，说明较低贮藏温度能够延缓鮰鱼片生化反应速率，且能有效降低鮰鱼片品质劣变速率[30-31]，同时这也使得前面不同贮藏温度下同种新鲜度指标的数值增加速率差异性的结论也得到了证实。此外，除近红外扫描指标TMA在259 K拟合精确度较低外，其他指标拟合精度R2均大于0.90，表明一级化学反应动力学方程能较好描述冻藏鮰鱼片的新鲜度变化，这为一级化学反应动力学方程和Arrhenius公式建立货架期预测模型提供了可行性。

将表2各指标不同贮藏温度下lnK与贮藏温度1/T作图进行线性拟合，结果如图5和表3所示。各新鲜度指标其拟合精度R2范围为0.9097～0.9633，这表明贮藏温度与反应速率常数K相关性高，模型预测效果好。且由表3也可知，鮰鱼片不同新鲜度指标反应速率常数K和活化能Ea也均存在着差异性，这可能是因为鮰鱼片在不同温度冷冻贮藏过程中各种化学反应速率存在差异性，其相应产物的累积也有所不同，也进一步证实了不同化学指标在评价鮰鱼片新鲜度方面存在着的差异性[30]。

表3 近红外扫描各指标的不同贮藏温度与反应速率常数K线性拟合结果

图5 近红外扫描各指标的不同贮藏温度与反应速率常数K线性拟合

经反应速率常数lnK与贮藏温度1/T进行线性拟合后，鮰鱼片TVB-N、TBA、TMA和K值的反应速率常数K0分别为6427.2367、356.9158、21.5980、1.9736，活化能Ea分别为29700.10 J/mo1、21078.48 J/mo1、15268.66 J/mo1、10006.73 J/mo1，将反应速率常数K和活化能Ea代入式(1)，可分别得到基于化学反应动力学方程建立的近红外TVB-N、TBA、TMA和K值的货架期预测模型计算公式：

式中：A0为相应指标的初始值；A为储藏t天后对应指标值；R为常数8.314 J/(mo1·K)，T为贮藏温度，K。

3.3 货架期预测模型的验证

为了验证基于近红外测定数据建立的化学反应动力学货架期预测模型稳定性，依据各指标的限定值、初始值和货架期预测模型公式计算出各新鲜度指标货架期的预测值，并且与近红外货架期扫描值(表1)进行对比，稳定性验证结果如表4所示，其中“-”表示在贮藏期结束时新鲜度指标未达到其限值，而无法确定货架期。结果表明货架期扫描值与预测值相对误差在-3.17%～5.71%，货架期预测模型的稳定性均在94%以上，即基于近红外测定数据建立的化学反应动力学货架期模型稳定性较好。

表4 不同贮藏温度下化学动力学货架期预测模型的稳定性验证

为了进一步验证基于近红外建立化学动力学货架期预测模型的准确度，将各货架期的预测值与理化检测的实测值(表1)对比，准确度验证结果如表5所示。货架期的实测值与预测值相对误差在-5.45～-2.95%，货架期预测模型的准确度均在94%以上，即货架期预测模型的准确性高。

表5 不同贮藏温度下化学动力学货架期预测模型的准确度验证

综合分析可知，基于近红外测定的数据建立化学反应动力学货架期预测模型其稳定性和准确度均在94%以上，说明本文基于近红外光谱结合化学反应动力学建立了良好的定温冻藏鮰鱼片货架期预测模型，这对定温冻藏淡水鱼的货架期预测具有重要的意义。

4 结论

1)分别在-6℃、-10℃、-14℃和-18℃冻藏鮰鱼片，随着贮藏时间延长近红外和理化分析测定的TVB-N、TBA、TMA和K值均呈现上升趋势，表明冻藏鮰鱼片的新鲜度逐渐下降。

2)随着贮藏温度升高，各指标的反应速率逐渐增加，符合一级化学反应动力学方程，且各新鲜度指标的反应速率常数K均具有较高的相关性(R2>0.90)。

3)经验证，各新鲜度指标的货架期预测模型期的稳定性和准确度均在94%以上，表明基于近红外快速测定的新鲜度数据建立的化学反应动力学货架期预测模型，能够实现对冻藏鮰鱼片进行可靠的预测。