细胞铁死亡与胎膜早破的相关性研究

肖文霞，宋佳荫

（北京市东城区妇幼保健计划生育服务中心，北京 100007）

胎膜早破是指宫缩前胎膜自然破裂[1]，是产科常见的并发症，其发病率在国内为2.7% ～17%，在国外为5% ～15%[2]。胎膜早破可引起脐带受压和脱垂、羊水过少、胎盘早剥、新生儿呼吸窘迫综合征、胎儿死亡、母体宫内感染及产后感染等[3]，严重危害母婴的健康和生命安全。因此，积极探索胎膜早破的发生原因及发病机制，并给予相应的干预措施，对于减少胎膜早破的发生、改善母婴结局具有重要的意义。然而，胎膜早破的确切病因及发病机制目前尚不明确，近年来人们主要从宫腔感染、营养、创伤、空气污染、社会心理、基因及内分泌等方面对胎膜早破的病因、病机进行研究。本研究旨在探讨细胞铁死亡与胎膜早破的相关性，以探索胎膜早破的发生原因及发病机制，为临床预防、治疗胎膜早破提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 基线资料

于2019 年1 月1 日至2020 年12 月31 日之间，选取我院产科病房收治的孕妇60 例作为研究对象。将其分为两组，其中胎膜早破孕妇30 例为病例组，正常足月妊娠孕妇30 例为对照组。两组均为单胎妊娠，无感染及其他临床发热征象，无内外科合并症及妊娠并发症；两组血、尿常规及肝、肾功能均正常。胎膜早破诊断标准：孕妇自诉阴道流液或外阴湿润等；窥阴器检查：见液体自宫颈口内流出或阴道后穹窿有液池形成；阴道液PH测定：PH ≥6.5 ；阴道液涂片检查：阴道后穹窿积液涂片见羊齿植物状结晶（《妇产科学》第9 版）。病例组年龄为22 ～40 岁，平均年龄为（29.2±0.4）岁，孕周为34+1～41 周，平均孕周为（38.2±1.3）周；对照组年龄为21 ～42 岁， 平均年龄为（30.3±0.3）岁，孕周为37 ～41 周，平均孕周为（39.1±0.3）周。

1.2 方法

1.2.1 标本制备 1）抽取两组孕妇的清晨空腹静脉血2 ～3 mL，置于含有枸橼酸的抗凝管内，在室温下充分凝血，以2000 r/min 的转速离心10 min，分离出血清，置于冰箱内保存待测。2）于剖宫产或阴道分娩后，取胎膜组织约1.5 ～3.0 g，以冷生理盐水漂洗至血块洗净，吸干，称重，置于冰箱内保存备用。

1.1.2 实验步骤 1）在已称重的胎膜组织中加9 倍的生理盐水，倒入放置于冰块的玻璃管内，充分研磨，然后以2000 r/min 的转速离心20 min，取上清液分装待测。2）用硫代巴比妥法测定血清和胎膜组织中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清和胎膜组织中的谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4）含量；用比色法测定血清和胎膜组织中的还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量，检测步骤严格按照试剂盒的说明书进行。

1.3 观察指标

比较两组孕妇血清及胎膜组织中的MDA 、GPx4、GSH 含量。分析胎膜早破孕妇血清与胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 含量的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0 统计软件对本研究中的所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，检验方法采用方差齐性检验及t检验；计数资料以% 表示，采用χ² 检验；对胎膜早破孕妇血清与胎膜组织中MDA、GPx4、GSH 含量的关系进行相关性分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较

病例组胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分别为（13.74±9.14）μmol/L、（4.63±11.49）ng/mL、（24.67±4.38）μg/mL， 对 照 组 胎 膜 组 织 中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分别为（8.76±7.54）μmol/L、（5.58±8.223）ng/mL、（38.22±7.46）μg/mL。 与 对照组相比，病例组胎膜组织中的MDA 含量明显升高，GPx4 和GSH 含量明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。详见表1。

表1 两组胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较（± s）

表1 两组胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较（± s）

注：* 与对照组比较，P ＜0.05。

GPx4（ng/mL）组别 MDA（μmol/L）GSH（μg/mL）病例组（n=30） 13.74±9.14* 4.63±11.49* 24.67±4.38*对照组（n=30） 8.76±7.54 5.58±8.223 38.22±7.46

2.2 两组血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较

病例组血清中MDA 、GPx4、GSH 的平均含量分别 为（12.11±10.42）μmol/L、（4.05±5.32）ng/mL、（20.32±5.73）μg/mL，对照组血清中MDA 、GPx4、GSH 的 平 均 含 量 分 别 为（7.86±6.87）μmol/L、（5.26±7.81）ng/mL、（32.16±8.97）μg/mL。 与 对 照组相比，病例组血清中的MDA 含量明显升高，GPx4 和GSH 含量明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。详见表2。

表2 两组血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较（± s）

表2 两组血清中MDA 、GPx4、GSH 含量的比较（± s）

注：* 与对照组比较，P ＜0.05。

GSH（μg/mL）病例组（n=30） 12.11±10.42* 4.05±5.32* 20.32±5.73*对照组（n=30） 7.86±6.87 5.26±7.81 32.16±8.97组别 MDA（μmol/L）GPx4（ng/mL）

2.3 胎膜早破孕妇血清与胎膜组织中MDA 、GPx4、GSH 含量的相关性

胎膜早破孕妇血清与胎膜组织中的MDA、GPx4、GSH 含量均呈正相关（r=0.467，r=0.517，r=0.543，P均＜0.01）。

3 讨论

3.1 细胞铁死亡

细胞铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡形式，以脂质活性氧堆积为特征[4]。“铁死亡”这一概念最早由Dixon 在2012 年首次提出[5]，ferroptosis 一词来源于拉丁语“ferrum”，意思是“铁”，以及希腊语“ptosis”，意思是“衰落”[6]。形态学上，铁死亡不同于坏死、凋亡和自噬，它既没有与坏死相关的形态学特征，例如细胞质和细胞器的肿胀，也没有与凋亡相关的表现，包括染色质浓缩、细胞收缩、凋亡小体形成及细胞骨架崩解，同时也没有形成典型的与自噬相关的双侧膜结构的自噬泡，其特征为明显的线粒体萎缩伴膜密度增加及线粒体嵴的减弱或消失[7]。生物化学上，铁死亡以产生有害的铁依赖性的脂质过氧化物为特征[8]。铁死亡是细胞死亡的一种形式，可由细胞的氧化系统尤其是Xc-（胱氨酸/ 谷氨酸反向转运蛋白）-GSHGPx4 依赖的抗氧化防御系统失活引起[8]。Xc-系统是哺乳动物细胞膜上的氨基酸转运蛋白，能将细胞外的胱氨酸转入细胞内并以1:1 的比例把细胞内的谷氨酸转出细胞外[9]。胱氨酸进入细胞内后转化为半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH 的重要前体。GSH 是小分子水溶性抗氧化剂，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的线性三肽[10]，在细胞内外都可以清除自由基以维持氧化还原平衡；GSH 也是GPx4 的辅助因子和底物，是GPx4 发挥作用所必需的物质。GPx4 是一种硒蛋白酶，属于GPx家族，是目前已知的GPx 家族中唯一能够将毒性脂质过氧化物（L-OOH）转化为非毒性脂质乙醇（L-OH）的酶[11]。细胞内的GSH 直接决定GPx4 的功能，GSH 缺乏可导致GPx4 失活，而GPx4 失活可引起脂质过氧化氢产物堆积，这是铁死亡的一个重要标志[4]。因此，GSH 和GPx4 是铁死亡的关键调节因子[12]。

最近的研究表明，铁死亡的最终执行者是脂质过氧化物[13]。脂质过氧化物是活性氧（ROS）家族中的一员。ROS 是氧分子部分还原形成的一类重要的氧化剂，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、脂质过氧化物（LOOH）和羟自由基（ROO-）等[14]。并非所有的ROS在铁死亡中都发挥作用，在铁死亡中发挥作用的主要是脂质过氧化物。脂质过氧化物主要在铁离子的催化下形成，铁是生物体内重要的微量元素，也是体内多种代谢酶的辅助因子，铁离子（主要是二价铁，Fe2+）可通过非酶性的芬顿化学反应和酶性反应促进脂质过氧化物的形成[15]。脂质过氧化物作为一种ROS，能通过多种途径诱导铁死亡：可以改变细胞膜的脂质双层结构、破坏离子梯度、降低膜的流动性、减慢扩散并增加膜的通透性而引起细胞铁死亡；可以引起细胞膜变薄、弯曲度增加及胶粒化造成膜损伤而引起细胞铁死亡；也可以通过其降解产物的毒性造成损伤：脂质过氧化物可进一步降解为醛，包括MDA 和4- 羟基壬烯酸（4-HNE），MDA 能与氨基酸或DNA 作用形成交联，4-HNE 也能与氨基酸形成共价产物，这些共价产物能改变蛋白和核酸的结构与功能，并对这些分子产生毒性作用[16]，从而导致细胞铁死亡。目前MDA、GSH 和GPx4 是常用的测定铁死亡的指标[17]。

3.2 细胞铁死亡与胎膜早破

本研究结果显示，与对照组相比，病例组胎膜组织中的MDA 含量明显升高，GPx4 和GSH 含量明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。这说明胎膜组织中存在着细胞铁死亡现象。已知胎膜是胎儿与母体之间的免疫和生理屏障，由羊膜和绒毛膜组成，并由细胞外基质连接在一起，而细胞外基质主要由胶原蛋白和蛋白多糖组成[18]。因此，胎膜从结构上可分为胎膜细胞和细胞外基质。胎膜破裂可能是由胎膜细胞死亡而引起，也可能由于细胞外基质变性、破坏而引起，还可能由二者共同作用引起。因此本研究推测胎膜早破可能是由于细胞受到内外刺激从而使细胞内二价铁离子浓度增加，通过芬顿化学反应和（或）酶性反应产生过量的脂质过氧化物，同时GSH 和（或）GPx4 降低，不能及时清除过量的脂质过氧化物，这些产物可能通过多种途径破坏细胞膜，引起胎膜细胞死亡，从而导致胎膜破裂；也可能由于过量脂质过氧化物的分解产物醛类与细胞外基质的胶原蛋白发生交联或形成共价产物，导致细胞外基质变性、破坏及降解而引起，还可能是上述因素共同作用的结果。本研究结果显示，胎膜早破孕妇血清与胎膜组织中的MDA、GPx4、GSH 含量均呈正相关，说明胎膜早破孕妇血清和胎膜组织中的铁死亡具有一致性，这更进一步说明胎膜早破孕妇体内存在着细胞铁死亡。

综上所述，细胞铁死亡与胎膜早破具有相关性。细胞铁死亡是一种调节性细胞死亡形式。近年来，人们对其分子机制及调控因素的研究越来越深入，并且发现铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂可抑制铁死亡。因此，研究铁死亡的调控机制，寻找调控靶点，有望成为预防与治疗胎膜早破的新途径。关于细胞铁死亡与胎膜早破的关系仍待进一步深入研究。