利用负载吲哚菁绿/姜黄素的聚合物胶束进行光热-化学联合抗菌可行性研究

曹茜楠，杨丽军，肖 萌，刘鉴峰

近年来，多药耐药细菌感染已成为威胁全球公共卫生的严重问题[1，2]，单一疗法的效果往往不如人意，因此亟需开发一种疗效好、耐药率低及全身毒性小的广谱性联合疗法，以实现在伤口感染处的特异性毒性激活，而不对正常组织造成损伤。由于具有特异性的药物递送、病灶处选择性精准释放药物及较低的全身毒性，外源刺激响应性聚合物胶束体系在对抗耐药细菌感染方面受到广泛的关注[3～6]。

吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）已被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床[7]。在近红外光（near infrared rad，NIR）照射下，ICG 吸收的光能主要转化为光热治疗的热量，还有一部分能量则被传递给邻近的水和氧气产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[8，9]。姜黄素（curcumin，Cur）具有广泛的生物活性，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等[10，11]。但由于其较差的水溶性和较低的生物利用率，Cur 的临床发展受到严重制约[12]。而两亲性聚合物胶束作为合适的药物递送载体为Cur 的体内应用创造了有力的平台。

据此，笔者所在课题组通过在强生物相容性亲水聚合物聚乙二醇[poly（ethyleneglycol），PEG]上键合疏水性ICG，并在所形成的两亲性聚合物自组装的过程中负载Cur，构建了一种具有NIR 响应性的ROS敏感型纳米聚合物胶束[姜黄素@聚乙二醇-硫代缩酮-吲哚菁绿[curcumin@poly（ethyleneglycol）-thioketal-indocyanine green polymeric micelles，Cur@PEG-TK-ICG PMs]，用于化学-光热联合治疗耐药细菌感染。当暴露于NIR 激光照射下，包裹Cur 的聚合物胶束Cur@PEG-TK-ICG PMs 首先通过ICG 将吸收的光能一部分转化为热量，使伤口感染处迅速升温实现光热杀菌，另一部分生成高水平ROS，切割聚合物的TK键使胶束分解，实现Cur 的快速释放。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料

甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺[methoxy-poly（ethylene glycol）-succinimide，PEG-NHS；相对分子质量2 000]、吲哚菁绿N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯（indocyanine green N-hydroxysulfo-succinimide ester，ICGSulfo-OSu）、2，2-丙烷-2，2-二基双（磺胺二基）二乙胺[2，2’-（propane-2，2-diylbis（sulfanediyl））diethanamine，NH2-TK-NH2]（西安瑞希生物技术有限公司，中国）；三乙胺 （trimethylamine，TEA）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、二乙醚（北京J&K 化学技术公司，中国）；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）、琼脂（北京索莱宝科技有限公司，中国）；9，10-蒽二基-双（亚甲基）-二甲酸[9，10-anthracenediyl-bis(methylene)-dimalonic acid，ABDA]（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，中国）；透析袋（1 000 u）（天津天南科技有限公司，中国）；RPMI 1640 培养液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco，美国）；Cur（上海梯希爱化成工业发展有限公司，中国）；酵母提取物、胰蛋白胨（OXOID，英国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（碧云天生物科技有限公司，中国）；96 孔板（Corning，美国）。所有的商业试剂都是直接使用。

小鼠胚胎成纤维细胞3T3 和小鼠成纤维细胞L929 均来自于实验室冷冻保存。

1.1.2 主要仪器

动态光散射粒度仪（Zetasizer Nano ZS）（Malvern Instruments，英国）；紫外分光光度计（UV-2550）（Shimadzu，日本）；透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）（Tecnai G2 F20 系统）（FEI，美国）；核磁共振波谱仪（300 MHz）（Bruker，德国）；纯水仪（Millipore，美国）；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，中国）；全波长酶标仪（Varios-kan Flash）（Thermo Scientific，美国）；化学发光成像仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司，中国]；808 nm 激光器（LIP20W）（Laserwave，中国）；红外热成像仪（ST20 MAX）（Fluke，美国）。

1.2 方法

1.2.1 高分子化合物的合成

将溶解在1 mL DMSO 的PEG-NHS（212.5 mg）溶液缓慢滴加到含有NH2-TK-NH2（29.2 mg）和TEA（10.2 mg）的DMSO（1 mL）中，在室温下避光搅拌反应24 h。之后，在搅拌下将所得混合物逐滴加入冷的二乙醚（100 mL）中，通过离心（3 500 r/min，5 min）和真空干燥，得到浅黄色沉淀物，即中间聚合物PEG-TKNH2（192.5 mg；产率87.3%）。随后，将PEG-TK-NH2（44.0 mg）、ICG-Sulfo-OSu（37.2 mg）和TEA（2.0 mg）加入到2 mL DMSO 中室温避光搅拌20 h，经过72 h的透析和48 h 的冷冻干燥后，收集到纯的深绿色PEG-TK-ICG 粉末（49.8 mg；产率85.4%）。

1.2.2 聚合物胶束的合成

空白胶束的制备：称取10.0 mg PEG-TK-ICG 于0.5 mL DMSO 中充分溶解，以1 滴/20 秒的速度加入到剧烈搅拌的9 mL PBS（浓度1 mmol/L，pH 7.4）中，室温搅拌10 h 以稳定胶束。随后将液体置于透析袋中透析72 h 后得到空白聚合物胶束——聚乙二醇-硫代缩酮-吲哚菁绿[poly（ethyleneglycol）-thioketal-indocyanine green polymeric micelles，PEG -TK -ICG PMs]。

负载Cur 的聚合物胶束的制备：按照同样的方法称取10.0 mg PEG-TK-ICG 和2.0 mg Cur 于0.5 mL DMSO 中充分溶解，以1 滴/20 秒的速度加入到剧烈搅拌的9 mL PBS（浓度1 mmol/L，pH 7.4）中，室温搅拌10 h 以稳定胶束。随后将液体置于1 000 u 透析袋中透析72 h 后得到载有Cur 的聚合物胶束——Cur@PEG-TK-ICG PMs。

聚合物胶束的药物包载效率（drug loading efficiency，DLE）和药物包载含量（drug loading content，DLC）通过以下公式确定。DLE（%）=（Cur 的包载质量/Cur的投料质量）×100%；DLC（%）= （Cur 的包载质量/聚合物胶束的质量）×100%。

1.2.3 聚合物胶束的表征

使用TEM 考察纳米胶束的形貌和尺寸；使用动态光散射（dynamic laser scattering，DLS）收集纳米胶束的动力学尺寸；利用紫外-可见分光光度计（ultravio let-visible spectrophotometer，UV-vis） 记录纳米胶束在300～900 nm 波长范围内的紫外-可见吸收光谱。

1.2.4 聚合物胶束的ROS 生成能力

分别量取2 mL PBS、ICG 和PEG-TK-ICG PMs溶液与溶解有50 μL ABDA 的DMSO 溶液混合均匀，得到相同ICG 质量浓度（0.5 mg/mL） 和ABDA 质量浓度（0.1mg/mL） 的一系列体系，使用808 nm 激光照射（0.8 W/cm2，10 min）后，通过酶标仪记录400 nm 处的光密度（optical density，OD）来监测纳米胶束的ROS产生情况。

1.2.5 姜黄素的释放

将1mLCur@PEG-TK-ICGPMs 溶液与9mLDMSO混合以分散聚合物胶束。然后，检测混合物在425 nm的OD，并根据浓度-OD 标准曲线确定Cur 的浓度。为了研究Cur 的释放情况，将1 mL Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液加入到透析袋中，随后将透析袋浸泡在9 mL PBS 中，在使用或不使用808nm 激光照射（0.8W/cm2，10 min）后，将体系放置于37 ℃恒温水浴；分别在预设时间点从体系中取出1 mL 溶液收集425 nm 处的OD值，同时向体系中补加1 mL PBS，重复操作直至结束。

1.2.6 聚合物胶束的光热升温行为

在石英比色皿中分别加入2 mL PBS、Cur@PEGTK-ICG PMs、PEG-TK-ICG PMs 和ICG 溶液（各体系中ICG 质量浓度均为50 μg/mL），随后使用808 nm激光照射（0.8 W/cm2，10 min），每隔30 s 通过红外热成像仪记录溶液的温度。

1.2.7 体外细胞毒性实验

胶束的细胞毒性实验以小鼠胚胎成纤维细胞3T3 和小鼠成纤维细胞L929 为模型。将生长状态良好的两种细胞以8 000 个/孔的密度分别接种于96 孔板中，在细胞孵箱中培养24 h 使细胞贴壁。将Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液用RPMI 1640 完全培养液稀释成一系列浓度梯度，向每孔加入100 μL 包含不同浓度胶束的培养液，每个浓度设置6 个复孔。培养24 h后通过CCK-8 评估聚合物胶束对细胞的毒性。

1.2.8 聚合物胶束的抗菌能力检测

1.2.8.1 细菌培养 在超净工作台内，取一个15 mL离心管，加入5 mL 溶菌肉汤培养液，用灭菌枪头轻轻挑取一个单克隆菌落，将枪头打入培养液中，再将离心管放入37 ℃恒温培养箱中于130 r/min 振荡培养过夜。

1.2.8.2 平板克隆法 细菌在600 nm 处会产生特定吸收，因此常用其在600 nm 处的OD 值（OD600）来衡量菌液中的细菌数量。将预先培养好的菌液浓度调整为OD600=4 左右待用。在超净台中准备4 个1.5 mL 的EP（eppendorf）管，分别向每个EP 管中加入100 μL菌液+300 μL PBS、100 μL 菌液+300 μL Cur、100 μL 菌液+300 μL PEG-TK-ICG PMs、100 μL 菌液+300 μL Cur@PEG-TK-ICG PMs，分别记为空白对照组、Cur组、PEG-TK-ICG PMs+NIR 组、Cur@PEG-TK-ICG PMs+NIR 组，使得最终Cur 的含量为0.12 mg/mL，胶束的质量浓度为0.5 mg/mL。未照射组在37 ℃条件下共孵育120 min；照射组在37 ℃共孵育30 min 后用808 nm 激光（功率密度0.8 W/cm2，10 min）照射后继续共孵育90 min。将三角形涂布棒在酒精灯上充分灭菌后静置冷却到室温待用，将不同处理后的混合液用溶菌肉汤培养液稀释4 万倍，分别取100 μL 稀释液滴到不同的固体培养基中心位置，用三角形涂布棒将稀释后的混合液涂匀，最后将培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后用化学发光成像仪拍照记录。

1.2.8.3 OD600法 将菌液浓度调整为OD600=1 左右待用，在超净工作台中准备1 个96 孔板，分别向不同孔中加入50 μL 菌液+ 150 μL PBS、50 μL 菌液+150 μL Cur、50 μL 菌液+150 μL PEG-TK-ICG PMs、50 μL 菌液+150 μL Cur@PEG-TK-ICG PMs，分别记为空白对照组、Cur 组、PEG-TK-ICG PMs+NIR 组、Cur@PEG-TK-ICG PMs + NIR 组，每组设置3个复孔，各材料浓度及处理细菌方法同上，孵育完成后使用酶标仪检测600 nm 处的OD600。

2 结果

2.1 聚合物的合成与表征

通过PEG-NHS、NH2-TK-NH2、ICG-Sulfo-OSu的两步酰胺化反应制备得到两亲性聚合物PEG-TKICG，具体的合成路线如图1所示。采用核磁共振氢谱对聚合物PEG-TK-ICG 进行结构表征（图2），其部分各峰归属如下所示：1.53（—CH3，c），1.89（—CH3，d），3.37（—OCH3，a），3.63（—CH2O—，b）。此外，根据对核磁氢谱图的综合分析，PEG-TK-NH2的TK 接枝率及聚合物PEG-TK-ICG 的ICG 接枝率均接近100%。

2.2 聚合物胶束的制备与药物包载表征

采用经典的溶剂交换法，通过亲疏水作用使得两亲性聚合物在水溶液中自组装形成具有疏水性核心与亲水性外壳的聚合物胶束纳米粒。疏水性药物Cur通过疏水相互作用被包裹在胶束的疏水核心部位，得到载药聚合物胶束Cur@PEG-TK-ICG PMs（图3a）。聚合物载药胶束形成了大小均一的球形纳米粒，平均尺寸约为90 nm，通过DLS 测量得到的平均流体动力学粒径约为95 nm，且粒径分布较窄，说明纳米粒尺寸均匀，与TEM 结果相吻合。如图3b 所示，在Cur@PEGTK-ICG PMs 的紫外-可见光吸收光谱中可以分别观察到ICG 的特征吸收峰（720 nm 和780 nm）和Cur 的特征吸收峰（425 nm），证明了ICG 成功共价连接且实现了姜黄素的有效负载。通过载药聚合物胶束离散后收集Cur 的紫外-可见光吸收光谱，根据Cur OD-浓度标准曲线及投料比计算，得到聚合物胶束的药物包载效率和胶束的药物包载含量分别为93.75 %和18.75%。

2.3 ROS 的产生

NIR 照射聚合物胶束产生ROS 使TK 键断裂是药物释放的前提。ABDA 作为检测单线态氧的探针，与ROS 反应后400 nm 处的特征OD400降低，通过监测溶液中ABDA 的含量可以对体系中ROS 的产生量进行定量分析。在808 nm 激光照射后ICG 溶液和PEG-TK-ICG PMs 均消耗了一定量的ABDA，证明二者在照射后均可有效产生单线态氧。值得注意的是，相比于ICG 溶液中产生的ROS 对ABDA 的消耗量（55%），PEG-TK-ICG 聚合物胶束体系中消耗ABDA的量有所下降（30%）。这主要归因于TK 键对部分ROS 的争夺消耗，导致体系中与ABDA 反应的ROS减少。见图4。

2.4 聚合物胶束NIR 响应性药物释放性能研究

为了评估载药聚合物胶束对NIR 响应性药物释放能力，进行了808 nm 激光照射（0.8 W/cm2，10 min）条件下的药物释放实验。通过记录NIR 照射后体系在425 nm 处的OD425，进而考察其NIR 响应性的药物释放行为，从而验证载药聚合物胶束的NIR 响应性。在无NIR 照射条件下，随着时间变化药物释放速率缓慢且累积释药量较小，即使在60 min 后累积药物释放率仍低于20%；而在NIR 照射条件下，Cur@PEGTK-ICG PMs 能够快速响应，在30 min 内即实现了负载药物的完全释放，证明了所设计的聚合物载药胶束具有优异的NIR 触发的释药能力。见图5。

2.5 聚合物胶束的光热行为研究

通过比较PBS、PEG-TK-ICG PMs、Cur@PEG-TKICG PMs 及游离的ICG 的温度变化来评估聚合物胶束的光热性能。在NIR 照射下，相同ICG 浓度的PEG-TK-ICG PMs 溶液、Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液和游离ICG 溶液均能快速升温，且随着时间的延长温度持续升高。在光照10 min 后，游离的ICG 溶液温度从20 ℃升高至49 ℃；值得注意的是，PEG-TKICG PMs 溶液和Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液温度均从20 ℃升至约53 ℃，且升温趋势类似。以上实验结果表明Cur@PEG-TK-ICG PMs 可被NIR 激活以实现快速的药物释放及温度的升高，优异的NIR 响应特性使其有望获得理想的抗菌效果。见图6。

2.6 聚合物胶束的细胞毒性测试

良好的生物相容性是聚合物胶束应用的前提。即使在Cur@PEG-TK-ICG PMs 的质量浓度达800 μg/mL时，小鼠胚胎成纤维细胞3T3 和小鼠成纤维细胞L929 的存活率依旧在90%以上，证明载药聚合物胶束具有良好的生物相容性，保证了进一步生物应用的安全性。见图7。

2.7 聚合物胶束的抗菌性能

为了进一步研究Cur@PEG-TK-ICG PMs 的抗菌活性，选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistant staphylococcus aureus，MRSA）作为模型菌。将MRSA 分别与PBS、PEG-TK-ICG PMs、姜黄素和Cur@PEG-TK-ICG PMs 共孵育，并对其进行激光照射或不照射处理后，采用菌落的平板克隆法和OD600法对纳米载药聚合物胶束的抗菌效果进行评估。Cur@PEG-TK-ICG+NIR 组形成的细菌菌落最少，对细菌的杀伤率达到90%以上，显示出最强的杀菌作用，PEG-TK-ICG+NIR 组和Cur 组对细菌仅显示出一定的损伤作用，说明Cur@PEG-TK-ICG PMs 可通过光热和抗菌药物的协同作用实现增强抗菌的效果。见图8、9。

3 讨论

为了抗菌，尤其是抗多药耐药细菌，越来越多的研究人员致力于探索非抗生素的抗细菌感染方法。生理环境的复杂性致使刺激响应性药物递送系统应对伤口感染处的内源性信号作出响应时存在选择性差、易脱靶等问题[13]。相比而言，NIR[14]、X 射线[15]、超声[16]等外源性刺激则能够以精准的位点选择性实现药物按需释放，从而获得研究人员的青睐。

在笔者研究中，成功构建了一种能够对NIR 刺激快速做出响应的ROS 自敏感型聚合物胶束（图10）。该聚合物在疏水相互作用下以93.75 %的药物包载效率负载抗菌药物Cur，并通过自组装策略形成尺寸约为90 nm 的均一球形聚合物胶束纳米粒。这一结果表明，通过两亲性聚合物自组装成为纳米胶束的策略能够实现疏水小分子药物的高效负载，拓宽了疏水药物在生物体中的应用。对比空白聚合物胶束PEGTK-ICG PMs 和载药聚合物胶束Cur@PEG-TK-ICG PMs 的吸收光谱，发现Cur 的包载并不会影响聚合物胶束的光学特性，这也证明了载药聚合物胶束对NIR的吸收能力不因药物的包载而受影响。相比于无NIR辐照的对照组，NIR 辐照能够激活聚合物胶束解聚使Cur 响应性地在30 min 内完全释放，同时ICG 在NIR辐照下引起的局部升温也将进一步加速药物的释放，这种NIR 智能响应激活的设计能够避免药物在正常组织器官处泄露造成的全身毒性，同时实现在伤口感染处特异性按需释放抗菌药物达到快速杀菌的目的。

与现有抗生素相比，该策略中所使用的药物对细菌种类并无特异性，NIR 这一外源性刺激的引入则赋予了抗菌以精准的位点选择性，化学-光热协同抗菌更展现出了增强的抗细菌感染能力。因此，笔者相信这种通过NIR 激活的化学-光热联合治疗的策略可以为耐药细菌感染的精准治疗提供新的途径，并有望在未来的临床试验中得到广泛的应用。