青贮原料表面微生物研究进展

张鸣珠， 黄 媛， 吴长荣， 朱 欣， 李龙兴， 陈光燕， 郝 俊*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省草地技术试验推广站，贵州贵阳 550025；3.贵州众智恒生态科技有限公司，贵州贵阳 550025）

青贮是一种将新鲜的饲草料切短装入密封的容器中，利用原料中附着的微生物或接种添加剂在厌氧条件下将牧草中的可溶性碳水化合物进行发酵并生成多种有机酸（主要是乳酸），导致酸碱度降低以抑制腐败和病原微生物,从而使饲料延长保存时间和保留营养价值的工艺。青贮饲料是一个厌氧发酵过程，由收获时在作物上附着的微生物驱动。不同的作物品种可以在根际、叶际和根内中选择性地组装各种微生物。与植物相关的微生物群在调节各种生物过程中起着至关重要的作用，并影响植物生长和发育所涉及的各种性状，以及植物对不利环境条件的反应（Lei等，2020；Wagner等，2020）。不同作物间的附生微生物组成不同，其对饲草青贮发酵品质的贡献也有差异。新鲜饲草表面微生物由细菌、酵母和霉菌的复杂混合物组成。一旦开始发酵，微生物群的多样性就会降低，因为专性需氧菌和酸敏感微生物被杀死，或者由于排除氧气和产酸降低了酸碱度而无法使其生长。在这些特殊条件下,附生的乳酸菌、肠细菌、酵母菌和霉菌会进入一种存活但不可培养的状态（Mcallister等，2018）。已有研究表明，由于作物表面附生乳酸菌数量较少，热带牧草的发酵青贮品质较差（Pholsen等，2016）。因此形成了一个共同的观点，即较高的乳酸菌初始计数保证了良好的发酵（Zhang等，2000）。Li（2019）和Zhang（2000）等的研究表明，与温带禾草相比，热带禾草具有较高的异源发酵乳酸菌群体，导致乙酸盐类型的发酵。此外，Kasmaei（2017）和Ferreira（2015）记录了不同牧草间附生乳酸菌数量的变化及其对青贮发酵质量的影响。因此，研究不同作物间的附生微生物区系分布及其对青贮发酵产生的影响十分必要。揭示作物的附生微生物组成，评价附生微生物群落对青贮发酵特性的贡献，可以为饲草品种选择提供参考。与青贮过程相关的附生微生物种群非常复杂，每种作物都有其特殊性，只有充分了解微生物多样性，才能改善发酵。本文就青贮饲料表面微生物组成、影响微生物种群的因素以及作物表面附着微生物对青贮发酵品质和有氧稳定性的影响等方面的研究进展作一综述。

1 青贮原料附着微生物

1.1 青贮原料表面附着微生物 青贮饲料的微生物群落主要来自饲料作物的叶层和下部茎。群落的组成根据作物品种及其生长环境而变化，甚至植物不同部位上附着微生物也有所差异（施雯等，2007）。Ruru（2021）对同一区域内六个不同品种玉米表面微生物进行研究发现，六个新鲜玉米品种的附生微生物群存在差异。泛菌属是所有新鲜玉米品种中最主要的附生细菌，然而六个玉米品种之间的次优势属绝对不同。Pang（2012）从青藏高原的玉米、苜蓿、三叶草、红豆草和印度鹅掌楸中分离到140株乳酸菌，并发现玉米比其他饲料作物含有更多的乳酸菌。假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、乳酸乳杆菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和副真乳杆菌（Weissella paramesenteroides）分别是苜蓿、三叶草、红豆草和印度鹅掌楸上乳酸菌种群的优势种。

青贮发酵取决于不同微生物群之间的竞争。因此，附生微生物群指导初始发酵并影响青贮饲料的发酵动态和模式。揭示牧草附生细菌群落有助于全面了解牧草发酵动态，提高牧草发酵质量（Xu等，2017）。存在植物表面上的微生物主要有：乳酸菌、酵母菌、肠细菌、霉菌、醋酸菌和其他好氧性细菌等（Rao等，2018；倪奎奎，2016；杨文琦等，2013），这些微生物各司其职，在青贮发酵过程中发挥着积极或消极的作用。厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是青苗期间数量最多的门（Liu等，2019；Ogunade等，2017）。乳酸菌和丙酸杆菌被认为是有利于青贮过程的细菌（Keshri等，2018）。乳酸菌一方面可以将青贮原料中的碳水化合物作为碳源通过催化发酵产生乳酸、醋酸、丁酸，提高氢离子浓度，从而达到酸性条件，抑制可能导致青贮产品腐败变质的有害微生物正常生长的目的；另一方面乳酸菌还具有与有害微生物竞争营养物质并产生细菌素等代谢物质的能力（Cai等，1999）。但一般情况下，由于植物附着乳酸菌较少不足以发挥其抑制作用，所以需要通过外源添加剂来帮助发酵（Amaral等，2020；Fabiszewska等，2019；Wilkinson等，2019）。随着对青贮乳酸菌发酵作用的不断深入研究，有些专家学者也先后提出了不同的观点，Gollop（2010）等发现，乳酸菌发酵过程中所产生的过氧化氢、细菌素以及一些目前不完全可知的代谢物也可以对青贮料中的各种微生物生长繁殖起到一定的抑制作用，这些积累的代谢物甚至也可能会抑制乳酸菌自身的生长。丙酸杆菌（Propionibacterium）的主要发酵产物为丙酸、醋酸、丁二酸以及二氧化碳（Thierry等，2011），丙酸和乙酸均为弱酸，具有抗真菌作用。

原料表面附着的酵母菌、霉菌等有害微生物会代谢产生霉菌毒素、丁酸、蛋白水解产物和细菌毒素等化合物，会导致青贮饲料的腐败变质、降低营养成分甚至会影响牲畜健康（Peng等，2017；Silva等，2015）。肠杆菌（Enterobacteriaceae）、醋酸菌、孢子形成菌 （芽孢杆菌Bacillus和梭菌Clostridium）和李斯特菌（Listeria）被认为是不理想的细菌（Pahlow等，2015）。一般认为芽孢杆菌对青贮发酵没有积极意义，因为芽孢杆菌在严格的厌氧条件下也能生长，能发酵有机酸和蛋白质并参与青贮饲料的有氧发酵过程。但某些枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）不仅可有效抑制青贮过程中霉菌生长,在有氧暴露后防止饲料腐败变质亦起到积极作用。Phillip（1992）等发现短小芽孢杆菌（Bacillus cereus）在防止高湿度紫花苜蓿霉变方面有显著成效，这可能与某些芽孢菌可产细菌素有关。醋酸杆菌属（Acetobacterium）对青贮饲料发酵具有消极作用，因为好氧的醋酸菌属可以迅速氧化乳酸和乙酸，导致青贮料酸性程度降低，同时干物质以二氧化碳和水的形式散失，从而引起青贮料因耗氧而腐烂变质（Vila等，2019）。很多研究表明，泛菌属在新鲜材料中显示出较高的相对丰度，但在青贮过程中急剧下降（Ruru等，2021；Zhihao等，2020；Ni等，2017）。Keshri（2018）等发现，小麦鲜样中的泛菌属丰度为34.7%，青贮6 h后达到46.3%，但随后持续下降，至青贮90 d后仅占0.02%。但泛菌属在新鲜作物中的作用及其消失原因仍不清楚，需要进一步研究。

1.2 附着微生物种群地理分布特征及影响因素微生物在发酵过程中发挥着重要的作用，因此了解影响微生物种群变化的因素就尤为重要。环境条件影响青贮饲料生产和利用的所有阶段（Bernardes等，2018）。气候可以通过决定一个地区的环境条件（如土、水、气、热等）来影响植物表面附着微生物的生长，从而间接地对青贮饲料品质发生作用（Gharechahi等，2017），比如在湿热的生长环境下植株表面更容易产生青霉菌属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和镰刀菌属（Fusarium）的霉菌（Samapundo等，2005）。

不同区域间的微生物可能会有一定的分布特征。韩吉雨（2009）指出，因为地区间大环境的变化，导致植物表面附着微生物不同，其中乳酸菌的变化，使作物青贮发酵品质出现差异。他对不同地区青贮玉米和苜蓿的细菌群落特征进行研究，发现同一区域作物原料表面附着的微生物种类总体相似性高达80%～93%。不同区域作物原料表面附着的微生物种类总体相似性较低，最高地区只有75%。而对同一或是不同地区青贮中细菌及乳酸菌的差异都很显著。包维臣（2019）发现，种植于内蒙古牧场的苜蓿青贮前主要细菌属为魏斯氏菌属（Weissella）、泛菌属（Pantoea）、欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡 萄球菌属（Staphylococcus），而Mc garvey（2013）等发现，种植在美国加州大学试验田内的苜蓿在青贮前主要菌属为欧文氏菌属、埃希菌属（Escherichia）、假单胞菌属、泛菌属、肠杆菌属（Enterobacter），表明不同区域和不同青贮原料品种间表面微生物多样性存在一定差异。

区域因素如温度、湿度、降水等，这些被认为是影响植物表面微生物多样性的主要因素（Muck等，2018）。Guan（2018）等发现，降雨和湿度影响玉米原料上的附生细菌群落，温度影响青贮过程中细菌种类的丰富度。降水量与青贮原料上乳杆菌属、醋杆菌属（Acetobacter）、乳球菌属（Lactococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）的相对丰度之间存在显著正相关关系。温度与甲基杆菌属（Methylobacterium）、鞘 氨 醇 单 胞 菌 属（Sphingomonas）、Aureimonas和德沃斯氏菌属（Devosia）的相对丰度呈负相关关系；然而，湿度与这些细菌的数量呈高度正相关，说明这些有害微生物适合在凉爽湿润的气候中生长。青贮后，尽管气候因素不影响青贮饲料中主要细菌的相对丰度（如乳酸杆菌、醋杆菌和明串珠菌），但温度会显著影响青贮期间的细菌物种丰富度。梁龙飞（2020）也对贵州不同区域全株玉米青贮过程中的菌群动态进行研究，发现细菌物种丰富度与温度呈极显著负相关，细菌群落多样性与降雨呈极显著负相关，乳杆菌属细菌相对丰度与温度呈显著负相关，这与Guan（2018）的研究中乳杆菌属相对丰度与温度呈正相关的结论不同。对于青贮微生物在不同地区和对不同气候条件的响应研究较少，有关这方面的讨论还要做进一步研究。

气候决定一个地区的环境条件，而海拔又是影响该地区气候变化的关键因素，海拔通过对气候的影响，可以间接地对植物和微生物的生长和生理特性产生作用。张娟（2017）研究发现，海拔与垂穗披碱草附着乳酸菌数量呈正相关关系，与酵母菌数量呈负相关关系，对霉菌数量的影响不显著。但青贮时间和海拔的互作对霉菌的数量、pH、乳酸、乙酸含量影响极为显著。陆永祥（2020）研究了不同海拔高度燕麦青贮的细菌群落，结果发现随着海拔升高，燕麦青贮饲料中乳酸菌的相对丰富度增加，而梭菌等不良细菌的相对丰富度降低；随着青贮发酵的进行，一些耐低温和厌氧微生物如乳杆菌和明串珠菌开始出现，而好氧嗜温的微生物如魏斯氏菌属和梭状芽孢杆菌等降低。

2 附着微生物对青贮发酵的影响

2.1 附着微生物对青贮发酵品质的影响 青贮需要经过有氧呼吸阶段、厌氧发酵阶段、稳定贮藏阶段和有氧暴露阶段（Pahlow等，2015）。在此过程中青贮原料表面附着的多种真菌和细菌进行代谢繁殖并表现出一定的规律性。张慧杰（2011）指出，发酵过程中各种微生物的数量基本上呈现缓慢变化、迅速增加、达到最大值后下降、最后稳定在较低水平的动态过程，青贮过程中微生物数量会出现两至三次升降变化。微生物的这一系列变化将引起青贮原料发生物理化学改变，从而影响最终青贮饲料营养和发酵品质。

青贮发酵的有氧呼吸阶段，植物呼吸作用和附着在青贮原料表面的假单胞菌属、埃希氏菌属和芽孢杆菌属等微生物开始利用作物的蛋白质和糖类进行繁殖代谢 （Vila等，2019；Shao等，2005），碳水化合物将被分解为氨基酸、乙酸、二氧化碳和水，降低饲料的青贮品质（Vila等，2019；Borreani等，2018）。有研究表明，当青贮饲料中的霉菌含量大于105CFU/g时，青贮营养品质会发生很大变化，淀粉含量开始下降，干物质（DM）损失大于20%；当霉菌数超过106CFU/g时，青贮DM的损失可能超过40%；当霉菌数高于107CFU/g青贮饲料时，DM含量低于10%（Borreani等，2018）。随着发酵的进行，在含有足够可溶性碳水化合物的压实良好的青贮饲料中，乳酸菌因其适应性特点在厌氧发酵阶段占主导地位，同时大量产生有机酸，贮藏环境酸性增强而抑制杂菌并提高青贮饲料的营养价值。Ruru（2021）和Zhihao（2020）报道，与新鲜牧草相比，青贮饲料中细菌群落的多样性和丰富度下降，并导致一些附生细菌的消失，因为其对青贮饲料中厌氧和酸性条件的适应性较低。此外乳酸菌在繁殖过程中与其他杂菌进行营养竞争也会抑制有害微生物的繁殖，从而改善青贮品质。发酵结束后乳酸菌成为大多数青贮饲料中的优势菌属。Keshri（2018）等研究表明，乳酸杆菌最初以非常低的丰度出现，但青贮90 d后相对丰度持续增加到59.5%。Guan（2018）等的研究报告了类似的结果，发现乳杆菌是玉米青贮饲料自然发酵中的优势微生物属（＞50%）。Gharechahi（2017）和Ogunade（2017）等研究表明，在整个青贮过程中，所有作物样品中乳酸菌的丰度都在上升。虽然不同种类和特性的附生乳酸菌会改变和影响发酵进程和青贮饲料的质量，但附生乳酸菌的种群并不总是足够多或具有合适的组成以促进有效发酵（Pang等，2012），难以达到低pH环境，反而导致梭菌活动旺盛，蛋白质分解加剧，致使青贮饲料品质下降。因此，许多学者研究如何通过接种微生物添加剂对青贮饲料中的微生物区系进行调控，增强第二和第三阶段发酵效率，有效提高青贮饲料的品质（Guan等，2020；Xu等，2020；Keshri等，2018）。不同种属的乳酸菌对青贮料的发酵品质和营养品质的影响不同，这是因为不同乳酸菌利用碳水化合物发酵产生的代谢产物不同。已有研究表明，乳酸主要由乳杆菌属和片球菌属中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、黑氏乳杆菌（Lactobacillus hammesii）、类消化乳杆菌 （Lactobacillus paralimentarius）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）5个细菌菌种相互促进代谢产生，而乙酸和苯乳酸主要由植物乳杆菌和短乳杆菌产生（包维臣，2019）。

外源微生物添加技术可极大改善青贮发酵品质，但附着微生物的作用依然不可小觑，通过研究原料中附着的微生物以研发专用的微生物添加剂已成为微生物研究的热门领域。Wang（2020）等将玉米和高粱植株的附生菌群接种到燕麦中，发现其他牧草的附生微生物改变了青贮燕麦的微生物群落和青贮品质。黄峰（2020）等从甘蔗尾中提取附生微生物接种到象草和玉米秸秆中进行青贮，发现象草青贮饲料中粗蛋白质含量显著增加，而玉米秸秆青贮饲料中粗蛋白质含量没有显著增加，结果表明甘蔗尾附生菌能够迅速降低玉米秸秆和象草青贮中的pH，从而抑制

蛋白酶的活性和不良微生物的生长繁殖。已经有研究表明，与商业乳酸菌接种剂相比，接种附生乳酸菌的发酵效率更高（Yahaya等，2004）。在较高温度（50℃）下，商用乳酸菌接种剂如植物乳杆菌MTD-1（Lactobacillus.plantarumMTD-1）对青贮饲料质量没有积极影响，而两种筛选的附生乳酸菌菌株，乳酸乳杆菌GG13（Lactobacillus.acidilacticiGG13）和鼠李糖乳杆菌GG26（Lactobacillus.rhamnosusGG26）提高了青贮饲料质量（Gulfam等，2017）。

2.2 附着微生物对青贮发酵有氧稳定性的影响植物表面除了附着少部分有利于青贮发酵的微生物外，大部分附着着酵母菌、霉菌、梭菌、肠细菌等不利于青贮发酵的微生物，它们会引起饲料的腐败变质，甚至造成牲畜的食物中毒。开窖后的细菌群落会发生很大变化（Hu等，2018），乳酸菌数量开始下降。刘蓓一（2019）观测到有氧暴露第5天的乳酸菌数量最低，此时的优势菌群由乳杆菌属（Lactobacillus）转变为厚壁菌门和变形菌门的其他菌。空气对青贮饲料十分有害，可以使休眠的好氧微生物开始繁殖，降低青贮饲料的有氧稳定性。研究表明，开窖时酵母菌的数量与其有氧稳定性直接相关，青贮饲料的有氧稳定性较低时酵母菌或霉菌含量往往超过105CFU/g（Borreani等，2018；Ranjit等，2000）。这是因为酵母菌在pH 3.5时仍具有活性（包维臣，2019），并且能代谢乳酸和可溶性糖，从而提高pH，使青贮的内部温度升高，而形成的低酸性环境将无法对霉菌和李斯特菌（Listeria monocytogenes）等微生物产生抑制作用（Woolford，2010），最后导致青贮饲料的腐败。霉菌是青贮前期有氧呼吸阶段和有氧暴露后导致青贮饲料腐败变质的主要微生物。霉菌在繁殖过程中产生的真菌毒素并不影响青贮进程，但会对牲畜的生长和生产性能造成危害，不同菌种产生毒素的种类差异较大。从青贮有氧稳定性的角度出发，酵母菌的种类比数量更为重要，且通常与曲霉属、镰刀菌属和青霉属的生长有关，已经有研究发现即使某些青贮饲料中存在较多数量的酵母菌（大于104CFU/g FM）也能具有良好的有氧稳定性（Hu，2015）。而可以抑制这些有害微生物的乳酸菌对青贮饲料有氧稳定性的影响也是积极与消极并存的。作物中附着的同型发酵乳酸菌虽然具有可快速降低pH，减少干物质损失的优点，但是对青贮全株玉米有氧稳定性方面会产生负面影响，根据Muck（2018）报告，有1/3的研究发现同型乳酸菌降低了有氧稳定性，这在玉米青贮中比在牧草或豆科青贮中发生的多。而通过PK、HK途径发酵的异型乳酸菌能产生乙酸和丙二醇，这些短链脂肪酸是一种更有效的抑制酵母菌、霉菌等有害微生物的酸类物质，从而提高青贮饲料的有氧稳定性（Ferrero等，2018；Muck等，2018）。不仅如此，还发现异型发酵乳酸菌代谢产物中的细菌素、Renterin、抑菌肽和苯乳酸等物质也能够有效抑菌。其中对苯乳酸的研究更为广泛。研究表明，部分乳酸菌通过氨基转移酶将苯丙氨酸转化成苯丙酮酸，而后经过乳酸脱氢酶作用生成苯乳酸 （芦夏霏等，2014）。Ganzorig（2016）等从青贮中分离得到稀氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii），发现这种菌株代谢产生的苯乳酸和4-羟基苯乳酸对霉菌具有较强的抑制效果。

3 小结

微生物组学的不断发展为研究植物与微生物相互作用提供了一种有效的方法，促进了对整个植物相关微生物群落的研究。本文就不同作物间的附生微生物组成，附生微生物群落对饲草青贮发酵特性的贡献作一综述。青贮饲料的品质受到发酵过程中所涉及的微生物群落及其产生的代谢产物的影响。已经有较多研究集中于青贮设备、青贮环境、添加剂等人为因素对微生物群落的影响，从而改善青贮发酵品质和有氧稳定性，但是缺乏附生微生物群落对海拔、降雨量、温度、日照强度等自然因素响应以及附生微生物群如何影响青贮发酵的研究，饲料表面微生物是个复杂的体系，其对青贮发酵的影响亦是非常重要，需要更多的研究来了解附生微生物群如何影响青贮发酵进程。