复合微生物对四环素胁迫下多花黑麦草苗期生长和生理特性的影响

张 琛，李昌宁，姚 拓*，何 礼，陈 鑫，张 澜，席博爱

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070)

全球约40%～90%的抗生素通过家畜排泄物(尿液或粪便)进入土壤及水体，残留的抗生素通过富集作用对土壤质量、生物多样性及人类健康造成潜在威胁，解决兽用抗生素在土壤及水体中的残留是当前环境保护领域的难题[1]。

抗生素的生物降解主要包括植物降解、微生物降解及“植物-微生物”协同降解[2-3]。植物对抗生素的降解方式包括植物根系直接吸收抗生素并将其转化为无毒代谢产物，以及根系分泌物和相关酶类对抗生素的降解[4]。已有学者发现黑麦草具有降解土壤中多种抗生素的能力，其中对四环素的降解率为31.3%，并且种植黑麦草可缓解四环素对土壤微生物的抑制作用[5]。微生物降解抗生素是通过改变抗生素的结构和理化性质，将大分子的化合物进行分解，最终生成CO2和H2O[6]。许多微生物如假单胞菌、赭杆菌及枯草芽胞杆菌等均具有抗生素降解能力[7-9]。“植物-微生物”耦合修复是一种综合生物修复方法，能够最大限度地提高抗生素降解率。植物在受到抗生素污染时，根际微微生物可以促进根部对抗生素的降解，而不能够被降解的抗生素会在植物体内累积，最终达到降低污染物毒性，修复环境的目的[10]。张欣阳等[11]将四环素高效降解菌株接种到水生植物凤眼莲根际，发现接种菌株能够提升凤眼莲对四环素的降解效率，证明了“植物-微生物”耦合对环境中残留抗生素的降解起到了促进作用。

多花黑麦草(Loliummultiflorum)又称一年生黑麦草，具有根系发达、生物量大、抗胁迫和适应性广等优点，被认为是良好的污染物修复物种之一。目前抗生素的生物降解主要集中在单一菌株或复合菌剂方面，对于“黑麦草-菌剂”进行四环素降解的研究从未见报道。基于此，本研究以多花黑麦草及四环素降解菌系为材料，研究“黑麦草-复合菌剂”耦合对不同浓度四环素的降解效果，探索四环素残留对黑麦草根系形态及生理生化指标的影响，以期为植物-微生物耦合降解四环素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与培养

供试多花黑麦草(Loliummultiflorum)种子购于百绿国际草业有限公司(中国，天津)，品种为‘特高’。供试微生物为复合菌系，菌株为试验前期从稳定降解四环素菌群中分离出的X8,J3[12]，二者以1∶2体积比例混合，制备为复合菌剂MI。

1.2 试验设计与处理

选取黑麦草中籽粒饱满、大小均匀的种子30粒，种子消毒处理后均匀点于培养皿中于室温条件下进行萌发。1周后将材料分为两部分，一部分制作为根尖石蜡切片，具体操作为用刀片切取黑麦草1 cm根尖，在FAA固定液中固定24 h后，用70%无水乙醇冲洗并脱水，以二甲苯：无水乙醇=1:1溶液处理1 h后浸蜡包埋，使用莱卡切片机(RM2235)纵向切片后使用番红固绿染色并封片，通过光学显微镜观察根尖细胞形态[13]。另一部分进行水培用于研究四环素残留对黑麦草生长特性的研究，具体操作为选取长势均一的幼苗移入水培箱中，水培箱置于人工气候室中，温度25℃，湿度45%，光照强度2 000lx，16 h/8 h光/暗交替培养。各处理如表1所示，每个处理6重复。在培养过程中先利用霍格兰营养液将其培养至三叶一心后再进行处理，抗生素处理组分别添加50，100和150 mg·L-1四环素溶液；四环素降解菌系处理组在抗生素处理的基础上添加四环素降解菌系2.0%(以菌系和培养基体积比为基数)，连续培养35 d后对不同处理间的材料分别取样并测定相应的指标。

表1 不同浓度四环素及菌剂对黑麦草的处理

1.3 测定指标与方法

1.3.1黑麦草根长和苗长的测定 测量黑麦草根长苗长，苗长为从茎顶端生长点到根茎的距离[14]。

1.3.2黑麦草叶绿素含量的测定 黑麦草叶绿素含量测定采用比色法[15]：

Ca=13.95 A665-6.88 A649

Cb=24.96 A649-7.32 A665

Cx.c=(1 000 A470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245

Ca+b=6.1 A665+20.04 A649

式中Ca，Cb，Cx.c，Ca+b分别为叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及总叶绿素浓度(mg·L-1)。求得色素的浓度后，计算组织中单位鲜重的各色素的含量：

叶绿体色素的含量 =(色素浓度×提取液体积)/样品鲜重

1.3.3黑麦草细胞膜透性的测定 采用电导率法测定黑麦草幼苗的相对电导率[16]。

取大小相当的植物叶片0.1 g，6次重复，洗挣后用去离子水冲洗3次，用滤纸吸干表面的水分。将叶片剪成适宜长度，分别置于10 mL去离子水的试管中，盖上盖子后置于室温下浸泡24 h。用电导仪(DDS-11A型)测定浸提液电导R1，然后对其进行沸水浴加热30 min，冷却至室温，摇勾，再次测定浸提液电导R2，无离子水电导率为R0。根据以下公式计算黑麦草叶片相对电导率：

1.3.4黑麦草生物量的测定 用分析天平称量幼苗地上部和地下部鲜重，然后105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重，称量地上部和地下部干重[14]。

1.3.5黑麦草根系性状的测定 以清水冲洗幼苗根部获得完整根系，使用Scan-Makeri800Plus扫描仪(MICROTEK，中国)和LA-S植物根系分析仪对其进行扫描及分析，获得3项根系相关指标数据：总根长、总根面积和总根体积[17]。

1.3.6黑麦草抗氧化酶活性的测定 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)活性的测定采用试剂盒测定(苏州梦犀生物医药有限公司)。

1.4 数据处理

本研究采用R软件(Version 3.6.1)对同一四环素浓度(50，100，150 mg·L-1)处理的黑麦草生长及生理指标进行T检验(Student′s t test)，对不同浓度之间进行单因素方差(One-way ANOVA)统计分析。

2 结果与分析

2.1 四环素胁迫下菌剂对多花黑麦草幼苗根尖结构、根长和芽长的影响

通过四环素(50，100，150 mg·L-1)处理黑麦草种子(图1A、B、C)，发现四环素处理下黑麦草根长苗长均受到了抑制，抑制程度表现为150 mg·L-1>100 mg·L-1>50 mg·L-1。添加菌剂能够减弱四环素对黑麦草根长和苗长的抑制作用。为了明晰四环素胁迫下菌剂对抑制作用的缓解效果，筛选出100 mg·L-1四环素及100 mg·L-1四环素+MI处理进行石蜡切片，观察四环素对根尖细胞生长的影响。

对100 mg·L-1四环素处理下的黑麦草幼苗根尖部位进行石蜡切片，发现对照组黑麦草根冠轮廓趋近于不规则的钝化圆弧，不能形成完整帽状覆盖根尖；分生区部分细胞涨破；顶端分生组织细胞排列混乱(图1D)。添加菌剂后根尖整体外观增粗且细胞组织界线更加清晰(图1E)，其中根冠部位细胞增多，形态恢复为正常的锥形圆弧；根尖边缘的细胞排列紧密规则；顶端分生组织细胞排列规则且径向层数较多，呈向下生长的趋势。整体根尖细胞的数量和形态均得到了改善。

图1 四环素胁迫下菌剂对黑麦草生长的影响

本试验发现添加菌剂能够缓解四环素对黑麦草根长芽长的抑制作用(图2)。四环素浓度为50 mg·L-1时，处理组MI的根长与CK相比增加了34.32%，芽长增加了17.08%。添加浓度为100 mg·L-1和150 mg·L-1时，MI处理下的根长与对照相比分别增加了23.92%和28.04%，芽长分别增加了21.83%和19.19%。

图2 四环素胁迫下菌剂对黑麦草根长和芽长的影响

2.2 四环素胁迫下菌剂对多花黑麦草色素含量和细胞通透性的影响

本研究分析了不同四环素胁迫下菌剂MI对黑麦草色素含量和细胞通透性的影响(图3)，发现在四环素浓度分别为100 mg·L-1和150 mg·L-1时(图3A)，MI处理下的叶绿素a含量显著高于对照，增加量分别为27.90%(P<0.05)和81.63%(P<0.001)；在50 mg·L-1时叶绿素a的含量增加但不显著。四环素浓度为50 mg·L-1及150 mg·L-1时(图3B)，菌剂MI可使叶绿素b含量极显著高于对照(P<0.001)，分别增加了28.08%,55.26%；在100 mg·L-1时增加了57.75%。在四环素浓度为50 mg·L-1和150 mg·L-1时，MI可使类胡萝卜素的含量显著高于对照(P<0.05)，与对照组相比分别增加了22.63%，20.83%(图3C)；100 mg·L-1时MI处理下的类胡萝卜素含量极显著高于对照，增加了25.15%(P<0.01)。在四环素浓度为50 mg·L-1和100 mg·L-1时，MI处理可使总叶绿素含量显著高于对照处理(P<0.05)，与对照组相比分别增加了9.11%,29.46%(图3D)；在四环素浓度为150 mg·L-1时，MI可使总叶绿素含量极显著高于对照(P<0.001)，增加了73.32%。此外，本研究探究了四环素胁迫下添加菌剂MI对黑麦草细胞通透性的影响(图3E)，其中四环素浓度为50,100和150 mg·L-1时，MI处理下的黑麦草相对电导率均表现为显著降低(P<0.05)，与对照组相比分别降低了34.34%,13.67%,11.94%；而未经四环素处理的相对电导率降低量不显著，与对照相比降低了22.69%。

图3 四环素胁迫下菌剂对黑麦草色素含量和细胞通透性(相对电导率)的影响

2.3 四环素胁迫下菌剂对多花黑麦草生物量和根系性状的影响

本研究发现在四环素胁迫下黑麦草的株高和根长生长均受到抑制(图4A)。经MI处理后，0，50和150 mg·L-1浓度下的株高显著增加(P<0.05)，与对照相比分别增加了19.77%，15.71%和32.03%；100 mg·L-1浓度下株高增加但不显著，与对照相比增加了13.63%。添加菌剂后0 mg·L-1和150 mg·L-1浓度下黑麦草根长显著增加(P<0.05)，与对照相比分别增加了30.1%和46.46%，100 mg·L-1浓度下根长增加但差异不显著。

随着四环素浓度的增加，添加菌剂可使黑麦草地上鲜重与对照相比分别增加11.22%，21.60%和1.78%(图4B)，并且添加菌剂能显著促进100 mg·L-1的地上干重和150 mg·L-1及地下干重(图4C)。

本研究发现，随着四环素胁迫浓度梯度的增加，黑麦草根系体积，根系直径、根系表面积及总根长均受到抑制作用，但添加菌剂对黑麦草根系受到的四环素胁迫作用有所缓解(图4D,E,F)。添加菌剂后，黑麦草根体积及根直径均显著大于对照(P<0.05)，根体积的变化范围为2.61%～31.24%。添加菌剂后，四环素胁迫下的黑麦草根表面积显著高于对照组(P<0.05)，与对照相比根表面积的变化范围为12.21%～19.53%。总根长与对照相比均有增加，其中浓度为50 mg·L-1和150 mg·L-1时菌剂处理下的黑麦草总根长显著高于对照组(P<0.05)，分别提高了19.00%和27.24%。

图4 四环素胁迫下菌剂对黑麦草生物量和根系性状的影响

2.4 四环素胁迫下菌剂对多花黑麦草丙二醛和抗氧化酶活性的影响

本研究测定了四环素处理下菌剂对黑麦草抗氧化酶活性的影响(图5)。当四环素浓度为0 mg·L-1时(霍格兰营养液)，添加菌剂对黑麦草MDA含量没有显著影响(图5A)；随着四环素浓度的增加(50～150 mg·L-1)，MDA含量显著增加，添加菌剂能显著降低黑麦草MDA含量(11.86%～25.29%)，其中四环素浓度为150 mg·L-1时，添加菌剂后MDA与对照相比下降25.29%(P<0.01)。当四环素浓度为0 mg·L-1时，添加菌剂对SOD活性没有显著影响(图5B)；黑麦草SOD的活性在四环素浓度为50 mg·L-1和100 mg·L-1时表现为升高，添加菌剂可使SOD活性升高2.75%和0.80%，而在150 mg·L-1浓度时降低6.36%(P<0.05)。POD的含量在四环素浓度为0 mg L-1时，添加菌剂对POD活性没有显著影响(图5C)；随着四环素浓度的增加(50 mg·L-1～150 mg·L-1)，POD活性呈现增加趋势(12.68%～49.12%)，当四环素浓度为50 mg·L-1～150 mg·L-1时，添加菌剂可使黑麦草POD活性分别增加49.12%(P<0.05)和12.68%(P<0.01)。在四环素浓度为0 mg·L-1时，添加菌剂对CAT活性没有显著影响(图5D)；当四环素浓度为50 mg·L-1和150 mg·L-1时，添加菌剂可使黑麦草CAT活性升高51.53%和30.08%(P<0.05)，但在四环素浓度为100 mg·L-1时，添加菌剂可降低CAT活性24.78%(P<0.05)。

图5 四环素胁迫下菌剂对黑麦草丙二醛和抗氧化酶活性的影响

3 讨论

3.1 四环素胁迫下菌剂对多花黑麦草幼苗根尖结构、根长和芽长的影响

本试验发现在四环素的作用下黑麦草根长芽长减小，添加菌剂能够减弱四环素对黑麦草根长芽长的抑制作用。根长芽长受到抑制的原因可能是四环素阻碍了根尖细胞的有丝分裂及根部的养分吸收，进而使地上部分的发育受到阻碍[18]。添加菌剂后黑麦草根长芽长增大，这一现象在50 mg·L-1浓度下最为明显，原因可能是菌剂MI中的假单胞菌X8及耶氏酵母菌J3对四环素起到了降解作用，并对黑麦草起到了促生作用。黑麦草根系可能为微生物的繁殖提了良好的生存环境，提升了微生物的呼吸强度[19]。

通过电子显微镜对黑麦草根尖纵切进行观察发现，100 mg·L-1四环素处理下黑麦草根尖细胞损伤严重，添加菌剂能够减弱四环素对根尖细胞形变和生长抑制的作用。抗生素等物质的胁迫能够抑制植物根尖细胞的分裂和伸长，并对细胞造成遗传损伤[20-21]。四环素使黑麦草细胞壁疏松和使细胞膨胀，并使根尖内部组织界限模糊，这与植株发芽时根部颜色变浅，质地细软相对应。添加菌剂使黑麦草根尖细胞状态恢复，表现为细胞间隙减小、细胞排列整齐且大小均一、顶端分生组织区域分界清晰。根尖细胞形态恢复的原因一方面可能是菌剂促进了黑麦草根尖细胞分裂素的产生，使细胞数量趋于正常；另一方面黑麦草在微生物强化下对四环素起到了降解作用，减少了四环素含量，缓和了根尖细胞受到的毒性损伤。

3.2 四环素胁迫下菌剂对黑麦草色素含量和细胞通透性的影响

叶绿素作为植物体内最重要的色素之一，是评价非生物胁迫毒性对植物影响的重要参数[22]。本试验发现添加菌剂显著增加了四环素胁迫下黑麦草叶绿素含量。四环素能够对叶绿体基因表达以及叶绿素合成酶的活性产生抑制，造成叶绿素降解及光合色素代谢紊乱[23-24]。添加菌剂提高了黑麦草叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量，原因可能是黑麦草的根系分泌物有利于菌群的繁殖，菌群在适宜条件下对四环素进行降解，使黑麦草的毒性物质吸收量减少，植株叶绿体功能趋于正常。

植物受环境胁迫程度可由细胞膜的损伤程度表示，相对电导率是反应细胞膜脂过氧化的重要指标[25-26]。本试验中，四环素胁迫诱导黑麦草产生过多活性氧，造成植物质膜受损、细胞通透性增大、电解质外渗，添加菌剂能够减弱四环素胁迫对黑麦草细胞膜造成的影响。已有研究表明，四环素对植物细胞膜及线粒体膜造成氧化损伤，而加快葡萄糖的代谢可缓解氧化损伤[27]。添加菌剂降低黑麦草相对电导率的原因一方面可能是菌剂对四环素进行了降解，减弱了四环素对黑麦草细胞膜的毒性，另一方面可能是菌剂分泌的代谢物促进了黑麦草体内葡萄糖的氧化分解，缓解了因四环素胁迫造成的氧化应激，降低了细胞活性氧水平，维持了细胞膜稳定性。

3.3 四环素胁迫下菌剂对黑麦草生物量和根系性状的影响

本试验中，添加菌剂能够减弱四环素胁迫对黑麦草株高根长的抑制作用，且添加菌剂能够增加四环素胁迫下黑麦草鲜干重。四环素胁迫使黑麦草生物量减少，尤其是地上干重受到的影响较为严重，原因可能是四环素影响了黑麦草的净光合速率，导致其有机物积累的减少，脱水后干重降低。研究表明，抗生素胁迫能够阻碍细胞分裂素的产生，抑制番茄、黄瓜、苜蓿等作物的生物量[28-29]。添加菌剂显著增加四环素胁迫下黑麦草的株高根长及生物量，这可能是由于菌剂对四环素进行了降解，菌剂分泌的代谢物可能对有机物的累积起到了积极作用。研究发现，加入一株放线菌Act12后，Pb胁迫下黑麦草根的分蘖及根鲜重显著增加，说明微生物能促进黑麦草根的发育[30]。微生物可能产生了有机酸、酶、氨基酸等代谢产物，调节了植株根域微生态环境，刺激植物根系进行养分吸收。

植物根系特性是判断植物自身生长的重要指标[31]。本试验中，添加菌剂使四环素胁迫下黑麦草根系性状恢复，表现为总根长、根体积、根直径、根表面积的提高。四环素能够通过调节丙氨酸代谢、氮代谢等途径来影响黑麦草根系的正常生长[13]。添加菌剂可能对黑麦草生理代谢具有积极作用，促进了葡萄糖、半乳糖等物质的合成，提升了根尖中生长素的产生及运输速率。黑麦草产生根系分泌物可能为菌群所利用，刺激了微生物呼吸作用，使其对营养物质的利用率增大，加快繁殖，最终表现为降解四环素能力的增强。

3.4 四环素胁迫下菌剂对黑麦草丙二醛和抗氧化酶活性的影响

植物细胞内叶绿体和线粒体是产生活性氧的重要部位，活性氧的累积会引起植株体内MDA及抗氧化酶活性的变化[32]。本试验中，添加菌剂降低了四环素胁迫下黑麦草MDA含量，增加了50 mg·L-1和100 mg·L-1四环素胁迫下黑麦草抗氧化酶SOD、POD含量及50 mg·L-1下CAT的含量。活性氧的累积导致细胞产生膜脂过氧化，MDA作为膜脂过氧化产物，其含量越高表示植物受到的氧化损伤越严重。研究发现，添加菌株能够使非生物胁迫下植物MDA含量明显降低[33]。本试验中，菌剂减缓了四环素对黑麦草造成的膜脂过氧化，一方面可能是微生物增强了黑麦草根系抗氧化系统，提高了黑麦草对过多活性氧的清除能力，降低了细胞氧化损伤；另一方面可能是微生物及黑麦草对四环素起到了降解作用，减少了四环素在生长环境中的含量，降低了其对抗氧化系统的抑制作用。

植物能够通过提高抗氧化酶活性来清除因胁迫产生的过量活性氧，其中SOD能够清除超氧阴离子，减少自由基对植物造成的伤害；POD可以调节植物对病原体和创伤的反应，并清除植物体内过多的酚类物质；CAT能够作用于H2O2并将其歧化分解为H2O和O2，减少细胞受到的氧化损伤[34-36]。添加菌剂使黑麦草抗氧化酶含量上升，说明菌剂对四环素胁迫下黑麦草抗氧化系统起到了保护作用。研究发现，在非生物胁迫下添加微生物能够诱导植物抗氧化酶活性的增加，减轻细胞膜损伤程度[37-39]。黑麦草抗氧化酶含量提高的原因可能是菌剂对四环素进行了降解，提高了黑麦草对四环素胁迫的耐受性，增强了黑麦草抗氧化酶系统；菌剂分泌物可能调节了黑麦草细胞渗透势，稳定了细胞结构及酶类的合成，缓解了四环素对植物造成的氧化损伤。

4 结论

本文以四环素胁迫下多花黑麦草为材料，发现四环素胁迫可使多花黑麦草根尖细胞形态发生改变，主要表现为根冠区、根尖边缘及内部出现溃烂，菌剂可使根尖整体外观增粗，整体根尖细胞的数量和形态均得到改善。菌剂能够显著增加黑麦草色素含量(叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素)，促进根体积、根直径、根表面积、总根长和株高的增加，增加地上和地下生物量，降低相对电导率及MDA含量，提升抗氧化酶SOD,POD活性。