血清miR-301a、miR-197与GDM患者炎性细胞因子的相关性及预测妊娠结局的ROC分析

吴海芳，张海波，黄素静，韩一栩

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)会引发孕晚期流产、难产、先兆子痫及心血管疾病等不良结局，并且患儿为巨大儿、低血糖、窒息、合并代谢综合征的风险随之增高，严重威胁母婴健康[1]。临床研究表明，胰岛素抵抗是GDM的主要发病机制[2]。白细胞计数(WBC)是最常见的炎性指标因子，有研究证明，WBC可作为GDM的预测因子；白介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在GDM患者血清和胎盘组织中表达异常；C反应蛋白(CRP)主要由肝细胞合成，主要用于反映炎性反应。微小RNA(miRNA)可参与多种疾病的发生和发展过程。多项研究证实，多种miRNA与2型糖尿病的发生、进展密切相关[3-4]，但是其与GDM相关性研究的报道较少。因此，现分析血清miR-301a、miR-197与GDM患者炎性细胞因子的相关性及预测妊娠结局的价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月—2021年1月于海南医学院第二附属医院产科行产检并分娩的确诊GDM孕妇45例为观察组，并按照妊娠结局分为良好亚组25例和不良亚组20例。另选取同时期在医院产检并分娩的健康孕妇45例为对照组。3组年龄、体质量指数、孕周等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经医院伦理委员会批准(KY20191226318)，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①观察组均符合“妊娠合并糖尿病诊治指南(2014) ”[5]中相关诊断标准，0、1、2、3 h血糖界值分别为5.3、10.0、8.6、7.8 mmol/L，2个及以上时点≥上述数值诊断为GDM；②研究期间未服用糖皮质激素进行治疗。(2)排除标准：①合并严重神经精神损害者；②存在严重免疫系统疾病者；③合并心、肝、肾等器质病变者。

表1 3组一般资料比较

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-301a、miR-197检测：采集孕妇24～28周时晨起空腹静脉血5 ml，离心取上层血清，采用Trizol试剂盒提取总RNA，加入Trizol充分混匀后静置，乙醇沉淀并清洗RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA。取总RNA 2 μl作为模板，采用逆转录试剂盒将RNA 逆 转 录 为 cDNA，每个检测样本设3个复孔，以U6位内参照。miRNA表达量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。试剂盒由杭州碧云天公司提供。

1.3.2 WBC及血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP检测：上述血清，采用酶联免疫吸附法检测IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平；采用全自动细胞分析仪(sysmex XE500)测定WBC水平。试剂盒由杭州碧云天公司提供。

1.3.3 妊娠结局：统计观察组孕妇的妊娠结局，妊娠结局不良是指产妇发生产后出血、产褥感染及新生儿窒息、围产儿死亡等不良事件；妊娠结局良好是指生产顺利，母婴均无不良事件发生。

2 结 果

2.1 2组血清miR-301a、miR-197水平比较 观察组血清miR-301a高于对照组，miR-197低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 对照组与观察组产妇血清miR-301a、miR-197水平比较

2.2 2组炎性因子水平比较 观察组WBC及血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平均高于对照组(P<0.01)，见表3。

表3 对照组与观察组产妇炎性因子水平比较

2.3 观察组妊娠结局 良好亚组25例妊娠结局良好，母婴均无不良事件发生；不良亚组20例妊娠结局不良，其中产妇发生产后出血12例，产后发生产褥感染7例，新生儿发生窒息1例。

2.4 血清miR-301a、miR-197水平与炎性细胞因子相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，血清miR-301a与WBC、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平呈正相关(P<0.05)，血清miR-197与WBC、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平呈负相关(P<0.01)，见表4。

表4 血清miR-301a、miR-197水平与炎性细胞因子水平相关性分析

2.5 影响GDM患者妊娠结局的多因素Logistic回归分析 以GDM患者妊娠结局为因变量，以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-301a升高、miR-197降低均是影响GDM患者妊娠不良结局的独立危险因素(P<0.05)，见表5。

表5 影响GDM患者妊娠不良结局的多因素Logistic回归分析

2.6 血清miR-301a、miR-197对GDM患者妊娠结局的预测价值 绘制ROC曲线结果显示，血清miR-301a、miR-197及二者联合预测GDM患者妊娠结局的AUC分别为0.785、0.804、0.954，二者联合预测的AUC均高于单项检测(Z=5.239、4.263，P均<0.001)，见图1、表6。

表6 血清miR-301a、miR-197对妊娠结局的预测价值

图1 血清miR-301a、miR-197预测妊娠结局的ROC曲线

3 讨 论

GDM与妊娠结局密切相关。既往有研究结果显示，胰岛素抵抗是GDM发病的关键环节，多数孕妇的胰岛素分泌量可维持正常的糖代谢，而少数孕妇无法代偿上述变化，出现胰岛素抵抗，最终导致GDM的发生[6]。越来越多的研究表明，糖尿病患者存在体内细胞因子介导的慢性炎性反应，巨噬细胞、单核细胞及炎性因子可能参与糖尿病及其并发症的发生和发展[7-8]。GDM患者体内存在相同的发病机制，少数GDM患者在妊娠后期会发展成2型糖尿病，因此这种免疫反应诱发的炎性反应也加重了GDM患者的胰岛素抵抗。随着基因检测技术的推广，miRNA在GDM发病中的作用逐渐成为GDM研究的重点内容。

miRNA是一种单链的非编码RNA，由19～25个核苷酸组成，miRNA基因可位于整个基因组的任何位置，也可位于蛋白编码基因的内含子，但不论来自何处，其生物合成的过程基本相同[9]。miRNA基因可参与人体正常的生理过程，miRNA对神经元的发育重塑、树突棘的发育、杏仁核依赖记忆的形成及神经细胞有丝分裂后的存活均有重要作用[10]。有研究也证实miRNA与低分化乳腺癌、胃癌等多种癌症相关，其在糖代谢异常、胰岛素分泌、胰岛素抵抗等的发生过程中发挥了必不可少的作用[11]。另外miRNA可由胎盘分泌，并且稳定存在于母体，可通过调控细胞增殖、分化、凋亡等过程，参与胰岛素抵抗、糖代谢等妊娠期糖尿病的发病机制中，使其发生胎盘异常、胎儿血管内皮损伤等病理学改变，还可影响胎儿生长发育，对胎儿和母胎造成严重影响。其中miR-301a、miR-197是非常典型的miRNA基因，有学者证实，miR-301a、miR-197水平与机体炎性反应和免疫反应有关，miR-301a水平升高，miR-197水平降低，会导致促炎因子水平升高，损害有关器官结构和功能。本研究结果显示，观察组WBC及血清miR-301a、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平高于对照组，miR-197低于对照组，Manani等[12]研究表明，miRNA在GDM患者妊娠过程中发挥代谢和发育调节剂功能，可能参与其发病和妊娠结局等过程。Pearson相关性分析结果显示，miR-301a与炎性因子水平呈正相关，miR-197与炎性因子水平呈负相关，表明血清miR-301a、miR-197的异常表达与妊娠期糖尿病的发生发展有关，其可作为预测和治疗妊娠期糖尿病的重要靶点，与张帮林等[13]研究结果一致。

正常妊娠期间，T细胞的平衡从促炎性Th1转变为抗炎性Th2，当机体免疫功能紊乱时，保护性抗炎因子水平降低，胰岛β细胞功能紊乱[14]。miR-301a水平增加导致促炎因子水平升高，T细胞的平衡性转换受阻，引发胰岛素抵抗。血清IL-6可通过NF-κB炎性信号传导通路参与炎性反应，促使糖皮质激素分泌，升高血糖[15]。血清CRP与胰岛素抵抗密切相关，其会扰乱胰岛素合成和分泌机制，进而导致胰岛素抵抗加重[16]。血清TNF-α介导免疫炎性反应多个过程。上述结果进一步证实了血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP是促使胰岛素抵抗的重要炎性因子[17]。本研究结果还显示，二者联合预测GDM患者妊娠结局的诊断价值极高，提示血清miR-301a、miR-197有望作为GDM的潜在诊断指标，但这需要进一步扩大样本量及长期随访研究证实。

综上，血清miR-301a、miR-197的异常表达与妊娠期糖尿病的发生发展有关，其可通过调节抗炎和促炎的失衡导致妊娠期糖尿病的发生，二者联合检测对妊娠结局的预测价值较高，可作为治疗妊娠期糖尿病的重要靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

吴海芳：课题设计，实施研究过程，论文撰写；张海波：提出研究思路，论文审核，实施研究过程，进行统计学分析；黄素静：实施研究过程，数据收集；韩一栩：实施研究过程，参与论文修改