血清S100A8/A9与社区获得性肺炎患者严重程度及预后关联的回顾性队列研究

马开树 刘成坤 屈开新 张威 付林 赵卉

社区获得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)是指人体处于医院之外、社区环境中受到细菌、真菌、病毒或混合感染所发生的肺炎，是威胁人类健康的常见感染性疾病之一。流行病学研究表明，全球CAP患者死亡率占住院患者的4%～14%[1-2]。肺炎发展至重症肺炎时，除了引起呼吸系统的异常反应外，还损伤机体的其他系统，最终可能诱发急性呼吸窘迫综合症、脓毒症以及多器官损伤等[3]。目前，CAP已经成为发展中国家感染性疾病的最主要的死亡原因[3]。虽然病原学和影像学诊断已经取得了巨大发展，各种抗感染治疗也降低了CAP患者的ICU入住率，但是CAP患者死亡率一直居高不下。此外，临床医生根据经验诊断CAP的病情容易出现偏差，各种肺炎评分比较复杂、常涉及多个指标的联合应用，这些客观条件增加了CAP的病情诊断和治疗难度[4]。因此，寻找一种新的、快速的诊断方法或生物标志物对于提高CAP的诊治是非常迫切的。

警报素 S100A8和S100A9是S100家族中比较重要的两个单体蛋白，生理情况下结合形成异源二聚体S100A8/A9进而发挥生物学功能。S100A8/A9作为钙离子感受器，在中性粒细胞和单核细胞中丰富表达，S100A8/A9常与TLR4以及RAGE等细胞表面受体结合发挥生物学功能[5]。血清S100A8/A9在很多炎症性疾病中高表达，如慢性阻塞性肺疾病、风湿性关节炎、青少年皮肌炎以及炎症性肠病[6-8]。但是S100A8/A9是否参与CAP的发生、发展目前并不清楚。本研究拟通过一项回顾性的队列研究分析血清S100A8/A9水平与CAP患者的严重程度和预后之间的关联，阐述S100A8/A9在CAP疾病进展中的作用。

资料与方法

一、 研究对象

选择2018年11月至2021年3月就诊于阜南县人民医院呼吸与危重症医学科的CAP患者作为研究对象。所有CAP患者诊断参照《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[9]，且所有参与者均签署书面知情同意。排除标准：年龄小于18周岁者；孕妇；严重的免疫功能低下患者；合并有恶性的肺部肿瘤或肺结核；精神障碍、依从性较差的患者；住院之前在其他医院已进行抗生素治疗或其他干预。本研究符合医学伦理学标准，并由阜南县人民医院伦理委员会进行认证(FNLL20180012)。

二、 资料收集

收集所有受试者人口学信息，主要包括性别、年龄、BMI、是否合并基础疾病；收集临床检查资料，主要包括血压、血常规指标、肝功能、肾功能、致病源以及炎症因子等；CAP严重程度按照CAP严重性评分(CRB-65、CURB-65、PSI、SMART-COP和CURXO)进行评估。

三、 生物素双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA)

利用ELISA的方法检测血清S100A8/A9(CSB-E12149h)的水平，该试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。检测前试剂盒室温下平衡30 min。根据已知标准品浓度建立标准曲线。在预先包被抗体的测试孔中，加入标准品或血清，37℃孵育2 h，震荡洗板后加入辣根过氧化物酶标记的抗体37℃孵育1 h，然后继续加入终止液反应15 min，轻轻混匀，使用酶标仪检测吸光度值。根据已知标准品的浓度和相应吸光度值，绘制标准曲线方程，计算血清S100A8/A9水平。

四、 统计分析

结 果

一、 人口学信息和临床特征

111名CAP患者被纳入该研究，根据CAP患者血清S100A8/A9三分位数水平将所有CAP患者分为三组，分别为低S100A8/A9水平组(低<45.5 pg/mL)、中S100A8/A9组(45.5～110.5 pg/mL)和高S100A8/A9水平组(>110.5 pg/mL)。人口学信息和临床特征(表1)所示，性别、体重指数、血压和肝功能指标在三组人群间无差异。年龄、白细胞、中性粒细胞、肌酐、尿素氮、尿酸和IL-6随着血清S100A8/A9浓度升高逐渐升高；相反，淋巴细胞数随着CAP患者血清S100A8/A9升高而逐渐减低。此外，基础疾病在三组CAP患者中无明显差异。

表1 人口学特征和临床信息

二、 CAP患者和对照人群，入院血清S100A8/A9的水平

根据CAP严重程度评分，将CAP分成不同的等级，比较不同程度CAP患者入院时血清S100A8/A9水平的差异。结果(图1A)所示，根据CURXO评分将CAP患者分成轻度和重度人群，发现重度CAP患者血清S100A8/A9水平高于轻度患者。依据CURB-65评分，将CAP患者分成三个等级，发现评分为3～5的CAP患者血清S100A8/A9水平高于其他等级CAP患者(图1B)。此外，参照CRB-65评分，评分≥3的CAP患者血清S100A8/A9水平最高(图1C)。根据PSI评分将CAP患者分成四个等级，91～130分以及大于130分的CAP患者S100A8/A9水平显著高于评分低于90分的患者(图1D)。进一步根据SMART-COP评分分析CAP患者S100A8/A9水平，发现血清S100A8/A9水平随着SMART-COP评分升高而逐渐升高(图1E)。

图1 CAP患者和对照人群血清S100A8/A9水平

三、 不同预后结局CAP患者入院时血清S100A8/A9水平

根据CAP患者的住院时间，将CAP患者分成三组，分别为<9天组，9～16天组以及>16天组。比较不同住院时间CAP患者血清S100A8/A9水平，结果发现随着住院时间的延长，CAP患者血清S100A8/A9水平是逐渐升高的(图2A)。CAP患者在入院以后，其中有11(9.91%)名CAP患者死亡，死亡CAP患者在入院时血清S100A8/A9 (223.56±36.56 pg/mL)水平，显著高于存活患者血清S100A8/A9 (103.32±19.36 pg/mL)水平(图2B)。

图2 不同预后结局CAP患者入院血清S100A8/A9水平

四、入院血清S100A8/A9升高与CAP预后结局之间的关联

进一步分析CAP患者入院时血清S100A8/A9水平与死亡风险之间的关联，单因素Logistic 回归分析发现血清S100A8/A9升高增加了死亡风险(OR=1.235, 95% CI：1.042～1.687;P<0.001) (表2)；调整了年龄和性别，控制相关混杂因素后的多因素Logistic回归分析发现死亡风险与血清S100A8/A9水平依旧呈显著正相关(OR=1.315, 95% CI：1.115～1.879；P=0.038) (表2)。接下来继续分析了住院时间与血清S100A8/A9水平的之间的关联强度，尽管血清S100A8/A9水平与9～16天的住院时间之间无关联，但是单因素和多因素回归分析均发现CAP患者入院时血清S100A8/A9水平升高与>16天的住院时间呈显著正相关(OR=3.215, 95% CI：1.554～4.925，P=0.011；OR=2.354, 95% CI：1.225～6.897，P=0.023)(表2)。

表2 S100A8/A9 水平与 CAP患者预后之间的关联

五、血清S100A8/A9升高的危险因素

CAP患者血清S100A8/A9水平在入院时是显著升高的，为了分析血清S100A8/A9升高的危险因素，首先采用了单因素Logistic回归分析，结果表明年龄、体重指数，以及合并高血压、糖尿病以及心血管疾病均是血清S100A8/A9升高的危险因素(表3)。多因素Logistic回归分析表明年龄、合并高血压是CAP患者入院时血清S100A8/A9升高的危险因素(表3)。

表3 CAP患者血清S100A8/A9升高的危险因素

六、 血清S100A8/A9对CAP严重程度和死亡风险的预测效能

血清S100A8/A9对于CAP严重程度的预测性能通过受试者工作曲线(ROC曲线)被分析，结果如(图3A)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO以及CAP评分联合血清S100A8/A9(S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP，S100A8/A9+CURXO)对重症CAP患者的预测性能曲线下面积(AUC)分别为0.821，0.856，0.885，0.920，0.942，0.856，0.945，0.929，0.959，0.986，0.928。血清S100A8/A9水平在截断值169.56 pg/mL以上可能为重症CAP，血清S100A8/A9对重症CAP预测性能的灵敏度和特异度分别为76.8%和83.9%。血清S100A8/A9对于CAP患者的死亡风险被预测，结果如(图3B、表4)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO，S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP和S100A8/A9+CURXO对CAP患者死亡风险预测能力分别为0.854，0.657，0.641，0.587，0.674，0.678，0.795，0.835，0.898，0.869和0.868。血清S100A8/A9浓度在截断值232.68 pg/mL以上可能增加CAP患者的死亡风险，血清S100A8/A9对死亡风险预测效能的灵敏度和特异度分别为83.5%和86.9%。

图3 血清S100A8/A9水平对CAP的预测效能

表4 不同指标对于CAP患者严重程度以及死亡风险的预测性能

讨 论

CAP是临床上常见的呼吸道疾病，是导致住院患者死亡的主要原因之一。受诸多因素的影响，CAP的发生率呈逐渐升高的趋势，已经成为威胁我国民众健康和生命安全的重要公共卫生问题。由于CAP发病早期，常会表现出咳嗽、发热、呼吸困难等症状，还伴有腹泻、心悸等肺外症状，发病特征不明显，容易引起临床诊断的误差，因此对CAP患者进行及时而有效的诊断是非常有必要的。

既往研究发现，血清S100A8/A9在很多炎症性疾病中高表达，如慢性阻塞性肺疾病、风湿性关节炎、青少年皮肌炎以及炎症性肠病[6-8]。S100A8/A9在急性肺损伤中发挥着重要的作用[10]；L.sigmodontis感染诱发小鼠血清S100A8/A9升高[11]。因此，我们有理由推测S100A8/A9可能参与了CAP进程，但是缺少相关的临床流行病学和实验室研究证据。于是，我们检测了不同严重程度CAP患者血清S100A8/A9水平，结果提示随着CAP患者严重程度的加深，血清S100A8/A9水平也是逐渐升高的；回归分析发现S100A8/A9与CAP患者严重程度评分呈正相关。以上结果提示，S100A8/A9可能参与了CAP的发生及发展进程。

本课题也比较了不同住院时间CAP患者血清S100A8/A9水平，结果表明入院时血清S100A8/A9升高的CAP患者住院时间明显延长；同时也发现死亡患者在入院时血清S100A8/A9水平高于存活患者。于是我们进行了Logistic回归分析，结果发现入院时血清S100A8/A9的升高，延长了CAP患者住院时间和增加了死亡风险。此外，ROC曲线下面积分析发现尽管单独的血清S100A8/A9水平与CAP严重程度评分对于CAP患者严重程度以及死亡风险的预测性能无明显差异，但是血清S100A8/A9水平联合CAP严重程度评分显著增加了单独的血清或CAP严重程度评分的预测性能。以上结果表明，入院时血清S100A8/A9升高，增加了CAP患者的不良预后风险。

临床流行病学研究表明，高龄和合并基础疾病均加重了CAP患者的严重程度[12]。因此，在本课题中人口学因素对于CAP患者血清S100A8/A9升高的影响被分析。单因素Logistic回归分析发现年龄、体重指数、收缩压和舒张压的升高，以及合并高血压、糖尿病和心血管疾病均是CAP患者血清S100A8/A9升高的危险因素。进一步的多因素Logistic回归分析表明年龄增加以及合并高血压是CAP患者入院时血清S100A8/A9升高的独立危险因素，也是CAP患者不良预后的危险因素。

警报素 S100A8和S100A9在骨髓细胞中丰富表达，在中性粒细胞和单核细胞中合成和分泌，S100A8和S100A9通常形成异源二聚体S100A8/A9进而发挥生物学功能[13]。S100A8/A9作为钙离子感受器，S100A8/A9可与TLR4以及RAGE等细胞表面受体相结合，S100A8/A9与受体结合以后，可激活NF-κB和AP-1信号促进其核转位，激活的NF-κB和AP-1信号可进一步发挥转录因子的作用，促进下游炎症因子的合成与分泌[14-15]。因此我们推测，肺炎链球菌感染导致肺泡上皮细胞损伤，诱发S100A8/A9的释放，S100A8/A9的分泌通过与其受体的结合进而激活炎症信号通路引起炎症因子释放，炎症因子释放将进一步促进S100A8/A9的分泌，形成一个正反馈环路，不断诱发S100A8/A9的分泌和促进CAP的发生和发展。

综上，血清S100A8/A9与CAP患者严重程度以及不良预后呈正相关，入院时血清S100A8/A9越高，CAP患者住院时间和死亡风险也显著升高。此外，年龄增加和合并高血压是CAP患者入院时血清S100A8/A9升高的危险因素。因此，血清S100A8/A9可能在将来被用作CAP患者严重性和预后的一个早期诊断分子标志物。