衍生化HPLC法测定双氢睾酮制剂中的药物含量*

2022-12-01 12:48陈辉芳朱俊访刘亚娟
广州化工 2022年20期
关键词:睾酮制剂凝胶

聂 阳,陈辉芳,朱俊访,李 博,刘亚娟,丁 立

(1 广东食品药品职业学院制药工程学院,广东 广州 510520;2 广东岭南职业技术学院药学院,广东 广州 510663;3 广东食品药品职业学院实验实训中心,广东 广州 510520)

双氢睾酮(Dihydrotestosterone)是一种由人体自然产生的雄性激素,广泛分布于全身血液当中,可促进男性生殖系统的正常发育,对于第二性征的出现和维持有积极作用,临床上主要用于5α-还原酶缺陷所致性分化异常,鉴别诊断良性前列腺疾病[1-2]。目前,国内报道的双氢睾酮测定方法有两种:放射/酶联免疫法、质谱联用法,前者主要用于人体组织及体液临床检测,后者样品处理繁琐、检测费用高昂[3-5]。双氢睾酮双氢睾亦称17β-羟基-5α-雄[甾]烷-3-酮,因其化学结构中无可产生紫外吸收的生色基团,无法采用常规的HPLC法测定,因此,国内无双氢睾酮及制剂的HPLC测定方法报道。

衍生化技术利用衍生化反应使药物与衍生化试剂生成衍生物,以改变待测物的化学和物理性质,使其具有对紫外和荧光检测器有响应的官能团,则可以大大提高HPLC的检测灵敏度和检测范围[6-7]。本研究基于双氢睾酮的羟基与对硝基苯甲酰氯快速衍生化反应,反应产物产生明显的紫外吸收,建立衍生化HPLC测定双氢睾酮方法。本法灵敏度高,干扰少而选择性强,是双氢睾酮及其制剂质量控制的一个好方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

Agilent 1200 HPLC,配自动进样器和 DAD二极管矩阵检测器,美国安捷伦公司;Sartorious BS-224S电子天平,北京赛多利斯天平有限公司;JY92-2D超声波清洗机,宁波新芝生物科技有限公司;SH23-2恒温磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.2 试 剂

双氢睾酮原料(含量>99.1%),山东铂源药业有限公司;双氢睾酮制剂(凝胶、乳膏、粉针剂)实验室自制;对硝基苯甲酰氯,山西西亚化工科技有限公司;乙腈为色谱纯,美国Tedia公司;二氯甲烷、吡啶、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇均为分析纯,阿拉丁试剂有限公司;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX StableBond-C18柱(4.4 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.2%三乙胺水(95:5);柱温:25 ℃:流速:1.0 mL·min-1;检测波长:254 nm;进样量: 20 μL。

2.2 标准液的配制

精密称取双氢睾酮原料10.30 mg,加甲醇25 mL溶解,得浓度为412.00 μg/mL双氢睾酮储备液。取双氢睾酮储备液加甲醇稀释,制得不同浓度的标准液。

2.3 衍生化反应条件

称取样品溶液适量置于25 mL具塞圆底烧瓶中,用二氯甲烷-吡啶(5:1) 5mL溶解,加入对硝基苯甲酰氯0.20 g密闭,超声30 min,静置2 h,加水5 mL,超声30 min,转移至分液漏斗中,静置1 d,取下层清液,通过大孔吸附树脂柱(20 cm×2.0 cm)以70%乙醇300 mL洗脱,继以无水乙醇400 mL洗脱,收集无水乙醇洗脱液,蒸干,用甲醇溶解,定容至10 mL,备用。

2.4 供试品溶液的配制

精密称取双氢睾酮制剂约2 g,以乙酸乙酯30 mL回流提取2 h,挥尽乙酸乙酯后,取滤渣置锥形瓶中,加入甲醇20 mL,超声提取60 min,过滤,取滤液,挥干,将残渣按“2.3衍生化反应条件”进行衍生化反应,用甲醇溶解,转移至10 mL量瓶中,定容至刻度,用0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液20 μL,得供试品溶液。

2.5 系统适应性

按“2.2标准液的配制”项下操作,但不加双氢睾酮原料,再按“2.4供试品溶液的配制”项下操作,且不加对硝基苯甲酰氯,得阴性对照液。按“2.2标准液的配制”项下操作,得双氢睾酮标准液。按“2.2标准液的配制”项下操作,再按“2.4供试品溶液的配制”项下操作,得双氢睾酮标准液衍生物。按“2.4供试品溶液的配制”项下操作,得双氢睾酮凝胶衍生物。

取阴性对照液、双氢睾酮标准液、双氢睾酮标准品衍生化物和双氢睾酮凝胶衍生化物进液相按“2.1色谱条件”项下测定,HPLC色谱图见图1。在此色谱条件下,对照品和样品中其他组分可基线分离,与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,理论塔板数计算不低于3000。

图1 阴性对照液(A)、双氢睾酮标准液(B)、双氢睾酮标准品衍生化物(C)和双氢睾酮凝胶衍生化物(D)HPLC图

2.6 线性关系考察

精密移取双氢睾酮储备液0.5、1、2、3、1、2 mL,置50、50、50、50、10、10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,制备成浓度依次为4.12、8.24、12.36、24.76、41.20和82.40 μg·mL-1系列标准品溶液,按“2.4 供试品溶液的配制”项方法处理样品,吸取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积。以峰面积Y对质量浓度X(μg·mL-1)进行线性回归计算,得双氢睾酮的线性回归方程分别为: Y=84517X- 29.878,r=0.9997。结果表明,双氢睾酮在4.12~82.40 μg·mL-1范围内,其浓度与峰面积呈良好线性关系。.

2.7 精密度试验

取同一标准品溶液,按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品,进液相色谱仪测定,重复进样6次,计算双氢睾酮峰面积的RSD为0.89%,表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批的双氢睾酮凝胶,按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品,平行制备6份样品,吸取20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积计算含量。结果双氢睾酮的平均含量为24.7276 mg/g,RSD分别为1.55%,表明方法重复性良好。

2.9 稳定性考察

精密吸取同一批双氢睾酮凝胶供试品溶液20 μL,分别于0、2、4、8、12、16、24 h取样测定,计算双氢睾酮峰面积的RSD为1.18%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

精密称取双氢睾酮原料1.2012 g,加乙腈溶解,定容至50 mL,得浓度为24.024 mg·mL-1双氢睾酮高浓度溶液。取已知含量的同一批双氢睾酮凝胶,分别精密加入一定量的双氢睾酮高浓度溶液,按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品,进液相测定,计算加样回收率,结果见表1。

表1 加样回收试验结果

3 双氢睾酮制剂含量测定

分别取3种双氢睾酮制剂各3批,按按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品,精密吸取供试品溶液20 μL,注入液相色谱仪,计算含量,结果见表2。

表2 双氢睾酮制剂中药物含量测定结果(n=3)

4 讨 论

4.1 色谱条件的选择

本实验采用衍生化HPLC法,对双氢睾酮分子的羟基进行苯甲酰化反应,使最大吸收波长移至254 nm处;对流动相所用的比例进行系列试验,结果表明甲醇-0.2%三乙胺水为95:5时峰形最佳。对照品、供试品在本文色谱条件下均无杂峰干扰,提高了分离选择性和检测灵敏度,实现了对样品中干扰物质的分离和双氢睾酮的定量分析。

4.2 衍生化方法的优化

以苯甲酰卤作为衍生化试剂,应用于衍生化HPLC法在药物的含量测定中已有广泛应用[8-9]。本方法采用对硝基苯甲酰氯为衍生化试剂,从衍生剂与样品反应的最适浓度、反应温度、衍生反应时间、样品萃取、大孔树脂洗脱方法等,进行了衍生化方法的全面优化,建立了衍生化HPLC对双氢睾酮制剂中药物含量测定方法。

4.3 样品的提取

在样品提取上,对乙酸乙酯回流法、水煎醇沉法和超声提取法进行了比较。结果表明,回流提取法所测得双氢睾酮的含量明显高于超声提取和水煎醇沉法。对回流法的提取时间和温度进行了考察,确定2 h为最佳提取时间。提取温度在70~80 ℃时,提取率无明显变化。

5 结 论

实验结果表明,该方法快速、灵敏、准确,各项技术指标符合有关标准的规定。本研究建立的衍生化反应条件温和,产物稳定,样品进样前处理简单,可用于双氢睾酮的定量分析,为双氢睾酮制剂的质量控制提供依据,也可为其他类似物质的衍生检测提供参考。

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