加压毛细管电色谱法在中药分析中的研究进展*

张潇晗，牛丽颖,2,3，毕晓东,2,3

(1 河北中医学院，河北 石家庄 050091；2 河北省中药配方颗粒创新中心，河北 石家庄 050091；3 河北省中药材品质评价与标准化工程研究中心，河北 石家庄 050091)

加压毛细管电色谱(Pressurized capillary electrochromatography, pCEC)是结合了毛细管电色谱和高效液相色谱法的一种新发展起来的分离分析技术，其主要特点如下：(1)双重流动相驱动力：在传统压力泵驱动管路流体的基础上，在分离管理段前后增加电极结构，提供了电渗流的驱动力，在电渗流和压力流的双重驱动条件下，提供纳升到微升范围内的流速[1]；(2)双重分离机制：毛细管内填料可以提供色谱固定相的分配、吸附、亲和等分离机制，而且由于毛细管内径小，方便操作，制备固定相填料所需试剂用量少，适合研究级新型毛细管固定相的开发，同时，通过调节流动相pH调控分析物的不同带电情况，在电场作用下产生差速效应，使pCEC在分离机制上兼具毛细管微柱色谱和毛细管电泳的优势；(3)仪器结构灵活：由于采用毛细管作为分离管路[2]，可以通过多通阀切换等技术增加管路的复杂度，实现稳定进样、多维分离等功能，管路的维度也方便将pCEC整合到微流控芯片中实现仪器的微型化，检测器方面[3]，pCEC由于分离段末端有电极，可以方便与质谱的ESI结构对接，或者采用电化学检测方法，使其检测手段更为丰富。近些年对于pCEC的关注度越来越高，相关综述性文章也十分丰富，主要分为三大类：第一类是侧重pCEC原理和技术的总结[2]；第二类是对于毛细管色谱柱制备以及应用的总结[4]；第三类是关于pCEC在生物医学、环境、食品、蛋白质组学等新兴科技的应用[5]。本文聚焦加压毛细管电色谱在中药分析中的应用，从pCEC固定相、分析方法、应用研究等几个方面对近几年的文献进行归纳整理，并根据现有研究情况对pCEC技术的发展进行了展望，为pCEC在中药分析中开展深入研究提供了一定的参考(文章概况参考图1)。

图1 文章思维导图

1 pCEC固定相

分离常用的毛细管内径在50～250 μm范围，对其进行液体充填和控制需要的流速在微升/分钟的数量级，采用微量流速泵或者注射器即可方便实现物理填充，此外，由于毛细管内壁富含硅羟基，可以通过硅烷化试剂等方法进行化学修饰或者键合其他材料，相比采用钢柱的常规液相色谱，pCEC的固定相形式更为丰富，主要有填充柱、整体柱和开管柱三大类。

1.1 填充柱

毛细管填充柱指将粒度在1～5 μm的固体色谱填料填充至石英毛细管中，得到的色谱柱[4]。其中常用的反向填料是二氧化硅，常用的手性填充固定相有多糖和分子印迹聚合物等。作匀浆法是最为常用的填充方法，该方法的操作简单，对于设备的要求低。但是由于毛细管色谱柱不适用常规离柱的不锈钢塞子，柱塞过大可能会引起死体积过大。在实际制备柱塞的操作中容易出现气泡、重现性差、分离速度慢等问题，因此对于柱塞的制备较为困难。目前柱塞的制备方式主要有四种；烧结填充固定相法、硅酸钾-甲酰胺聚合法、溶胶-凝胶固结固定相法以及多孔有机聚合物[6]。 李英杰等[7]以羧基丁二酰β-环糊精微球为手性固定相制备7～10 μm填料内径的毛细管电色谱填充柱，拆分两种手性药物对映体和氨基酸，试验结果表明所制备的手性填充柱拆分能力好，四种对映体均得到基线分离。Yonglei Wu等[8]将L-半胱氨酸修饰在二氧化硅微球上制备出了一种新型高分子材料下的二氧化硅毛细管填充柱，用于糖肽类化合物的富集与分析，具有良好的灵敏度和选择性。

1.2 整体柱

毛细管整体柱是在毛细管内原位反应制得，分为有机聚合物整体柱①聚丙烯酰胺类整体柱；②聚苯乙烯类整体柱；③聚甲基丙烯酸酯类整体柱；④分子印迹整体柱、无机硅胶整体柱和有机-无机杂化整体柱[6]。有机聚合物整体柱的制备先对毛细管内壁预处理，再将单体、交联剂、制孔剂、引发剂混合液引入毛细管，发生原位聚合反应，最后冲洗制得[9]。硅胶整体柱的制备主要是溶胶-凝胶法。有机-无机杂化整体柱的制备主要是通过缩合聚合法和缩合聚合协同自由基引发聚合法。实验研究表明整体柱的内部结构均匀、重现性好、具有良好的多孔性、柱效高可实现快速分离，具有深入的研究价值。李英杰等[9]以烯丙基咪唑鎓β-环糊精为功能单体，EDMA为交联剂制备了一种毛细管电色谱整体柱，实验表明该毛细管整体柱对对映体的分离能力较强。李英杰等[10]以N-烯丙基咪唑β-环糊精和功能化Uio-66为单体制备了一种新型的杂化整体柱，该整体柱成功分离了喹禾灵和禾草灵两种手性农药对映体，实验表明该整体柱在拆分手性化合物方面具有很高的研究价值。

1.3 开管柱

毛细管开管柱是通过在柱内壁制备一种薄层固定相得到的，主要方式分别有键合法、涂布法以及溶胶-凝胶法。赵凌艺等[11]通过共价键合法制备了二维吖嗪COF涂层毛细管，用于分离硝基苯酚类环境内分泌干扰物，实验结果良好。刘元元等[12]合成了一种基于纤维状二氧化硅纳米和聚合物的新型二氧化硅纳米毛细管开管柱，成功的用于磺胺类物质的分离与分析中，实验重复性良好，为磺胺类等碱性物质的分析与分离提供了技术支持。Genlin Sun等[13]以乙烯二甲基丙烯酸酯为交联剂制备了一种毛细管开管柱，并完成对5种合成肽的分离。该实验为一些复杂的生物样品的分离提供了新思路。

表1 三类柱子的优缺点对比以及应用

2 pCEC在中药分析中的应用

目前药品市场上种类较多成分复杂，尤其对于一些中药制剂来说，分离分析难度更大。目前对于中药的分析分离方法主要有高效液相色谱法(HPLC)以及高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)，而HPLC法需要消耗较多的有机试剂，HPLC-MS法的仪器昂贵。加压毛细管电色谱所需有机试剂少，柱效高，分析速度快，因此近些年来加压毛细管电色谱技术在中药分析领域取得了良好的效果。pCEC在中药分析中的应用发表的相关文献年份分布参考见图2(知网检索)。

图2 相关文献发表年份分布

2.1 生物碱

吴漪等[14]以加压毛细管电色谱为技术平台,对中药黄柏指纹图谱中的方法学进行了研究。通过在色谱柱上施加不同的电压，发现了现黄柏中的主要成分药根碱、巴马汀和小檗碱随电压的不同出峰顺序不同，说明了pCEC对于一些复杂样品的分离是一种更有效的途径。吴孔弦等[15]采用pCEC, 建立了银杏叶的 pCEC指纹图谱。该方式所需试剂用量少，对于复杂样品的分析能力强，作者利用pCEC对10批不同产地的银杏叶药材进行分析测定，结果理想，对于银杏叶药材质量标准的建立提供了一种新的评价方法。分离生物碱时常采用C18柱子，常以甲醇-水，或乙腈-水为流动相，氨水或三乙胺为添加剂，可得到良好的分离效果。

2.2 黄酮类化合物

赵彦勇等[16]采用pCEC，建立了一种用于分离检测芎菊上清片中栀子苷和黄芩苷的高效简便的新方法。试验结果表明，该方法的选择性好、柱效高、试剂用量少，为中成药芎菊上清片的质量控制提供了依据。张平等[17]采用加压毛细管电色谱法测定复方芦丁片中芦丁与维生素 C 的含量，当电压加到-5 kV时基线分离，最终实验选定电压为-8 kV，该电压下峰型最好。与原国标方法相比，结果基本一致，并且该方法简单快捷、准确有效，为复方芦丁片质量控制提供了新检测技术。

2.3 醌类化合物

肖晓茹等[18]利用加压毛细管电色谱法分离检测虎杖根中蒽醌类成分，在电渗流和压力流的双重驱动下，分离速度与效能均有一定的提高，试剂消耗量少取得了良好的实验结果。颜流水等[19]建立了同时分离大黄提取液中的五类蒽醌类化合物的梯度加压毛细管电色谱新方法，实验显示利用pCEC五种醌类化合物可在22分钟内实现分离，该柱效是梯度微柱液相色谱的4.6倍。对于醌类化合物的分析分离常用的毛细管色谱柱是C18熔硅毛细管柱，建立了一种高效快速分离中药复杂体系中多成分组分的新方法，在中药这一类的复杂体系的质量控制中发挥了重要的作用。

2.4 糖苷类化合物

许歆瑶等[20]利用加压毛细管电色谱技术高效分离葛根多糖中的单糖，建立了柱前衍生加压毛细管电色谱检测糖类的方法。该方法与传统的液相色谱比较，分离速度和柱效大大提升。该研究为以后对于单糖类化合物的研究提供了一个新的高效快速分析分离方法。用pCEC分离单糖所使用的色谱柱为C18核壳型Halo柱，常用的检测器为紫外可见波长检测器。分离糖苷类化合物常用以硅胶为填料，键合了氨基甲酰基的色谱柱。王玉红等[21]利用加压毛细管电色谱-微流蒸发光散射检测联用仪检测果糖、葡萄糖和蔗糖。该实验优化了流动相、电场强度、温度等条件，与HPLC对比该方法快速灵敏并且经济环保，为糖类物质的检测提供了一种新的技术手段。

2.5 苯丙素类化合物

陈怡等[22]利用pCEC分离和定量分析白芷根中的香豆素类化合物，该实验在同等色谱条件下也进行了高效液相色谱和毛细管液相分离。试验结果表明pCEC的分离时间更短，柱效更高。胡延等[23]采用反向加压毛细管电色谱技术检测中药厚朴中和厚朴酚与厚朴酚，建立了一种快速简便的分离分析方法。该方法与传统的毛细管区带电泳法相比，灵敏度更高，重现性更好，流动相消耗少，绿色环保。

3 pCEC在其他方面的应用

近些年的研究总结中发现，对于新型毛细管色谱柱的合成和利用仍是研究热点。加压毛细管电色谱技术更多的应用到食品安全研究[24]、药物质量控制[25]、手性拆分[26]、以及分离蛋白质和多肽等的方面[27]。山梅等[28]，采用固相萃取-反相加压毛细管电色谱-紫外检测技术测定水体中八种农药残留，该方法简单、可靠、适用于水中多种农药残留的同时分析测定。柳青等[29]将pCEC与MS相结合，将电喷雾电离源的喷雾接口重新设计经行改造和优化，因此喷雾效率和检测的灵敏度都得以提高。该平台搭建的加压毛细管电色谱与质谱联用技术扩大了pCEC的应用领域，同时对于一些复杂的微量样品的分析提供了技术指导。对于加压毛细管电色谱的条件以及应用可参考见表2。

表2 加压毛细管电色谱的应用条件以及文献来源

续表2

4 结 语

随着现代医药的不断发展，中药对于人们来说也展示出越来越重要的作用。但是由于中药以及一些中药复方制剂的成分复杂，使得传统的分析分离技术受限，加压毛细管电色谱技术显示出来了极大的潜力。pCEC充分整合了毛细管微柱色谱、毛细管电泳的优势，可以针对生物、环境等复杂样品方便开发新型固定相，又与质谱、多维液相色谱、微流控芯片等技术具有很好的兼容性，今年来备受关注。同时pCEC在生物样品分析[40]、环境分析[41]以及食品分析[42]中也展现出了重要的应用价值。加压毛细管电色谱作为一种药典上没有收录的新方法，pCEC较多的应用于各大高校，而对于各个企业应用较少。加压毛细管电色谱技术的“心脏”是毛细管色谱柱，毛细管色谱柱在一定的程度上影响了物质的分离效果，因此毛细管色谱柱的制备仍是研究的重点[43]。色谱柱由传统的色谱柱发展为现在的毛细管色谱柱，柱子发展的越来越细，符合现在硬件设备的“微信化”，将来毛细管色谱柱的进一步发展成无线检测。加压毛细管电色谱与微流控芯片结合[44]，实现超快分离，发展成一台便携机器，更加方便地应用于食品药物，环境等方面的检测。尽管加压毛细管电色谱技术的开发研究时间较短，但是近几年pCEC作为一项新型的分析分离技术发展迅速，逐渐成熟，必将拥有广阔的应用前景。